自噬对血管平滑肌细胞增殖的影响

论文摘要

目的:探讨自噬作用与血管平滑肌细胞（VSMC）增殖之间的关系。为防治VSMC异常增殖提供新的理论依据。实验方法:用健康SD大鼠的腹主动脉进行VSMC的原代培养,培养基选用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM,培养条件为5%CO2、37℃。培养3～5天有细胞爬出,7～9天左右可进行第一次传代。根据检测方法的不同可分为:①用于免疫细胞化学检测的细胞接种于放有小圆玻片的24孔板内,细胞按5×104个/ml细胞密度,每孔1ml。②用于免疫印迹检测的细胞接种于50ml培养瓶中,细胞按5×105个/ml细胞密度,每瓶3ml。实验选用3～6代VSMC,VSMC传代后静置培养16 h,等细胞完全贴壁后换用含0.5%FBS的DMEM培养24 h进行同步化处理（使所有细胞处于细胞周期的静止期）,随后分为七个组:①对照组;②雷帕霉素（RPM）组（10 ng/ml）;③3-甲基腺嘌呤（3-MA）组（10 ng/ml）;④凝血酶（F2）组（1 U/ml）;⑤雷帕霉素（10 ng/ml）+凝血酶组（1 U/ml）;⑥3-MA（10 ng/ml）+凝血酶组（1U/ml）;⑦雷帕霉素（10 ng/ml）+胃酶抑素（Pep）组（0.01μmol/ml）。不同药物处理后继续培养48 h,通过免疫细胞化学、免疫印迹方法检测各组VSMC的增殖细胞核抗原（PCNA）和微管相关蛋白轻链3（LC3）的表达变化。结果:一.自噬对VSMC增殖的影响实验分别用雷帕霉素和3-MA作用VSMC,用免疫细胞化学和Western Blot方法检测PCNA、LC3表达变化,结果表明:雷帕霉素作用VSMC后与对照组相比能明显抑制其增殖（P<0.01）,而3-MA则促进VSMC增殖（P<0.01）。Western Blot检测PCNA蛋白表达结果进一步表明F2能促进平滑肌细胞的增殖,但与雷帕霉素共同作用时,F2的促平滑肌增殖作用大大降低（P<0.01）,3-MA与F2共作用时有促VSMC增殖作用。二.增殖因素（F2）对VSMC自噬与增殖的影响凝血酶（F2）是促VSMC增殖剂,在VSMC中加入F2后LC3表达有所降低,PCNA的表达明显上调;F2与雷帕霉素共同作用时,LC3的表达明显上升,而PCNA则显著下调;但与单独使用雷帕霉素组相比LC3的表达量又有一定降低,F2与3-MA同时作用时,自噬被抑制,而PCNA明显上调,与单独使用3-MA的组相比LC3的表达量也有一定降低。三.自噬抑VSMC增殖的机制研究实验选用胃酶抑素抑制溶酶体途径,检测LC3、PCNA的表达变化,结果发现,胃酶抑素与雷帕霉素共同作用时,LC3表达上调,而PCNA的表达与雷帕霉素组相比明显上调,与3-MA组相比PCNA表达更显著。结论:1、雷帕霉素的抑VSMC作用与自噬激活有关,自噬作用能抑制VSMC增殖。2、促进细胞增殖因素（F2）有降低自噬水平的作用,但效果不显著。3、自噬抑VSMC的作用机理与溶酶体途径有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 材料与方法
• 【实验材料】
• 一、实验动物
• 二、主要试剂
• 三、主要仪器设备
• 四、主要试剂的配制
• 【实验方法】
• 一、血管平滑肌细胞的培养
• 二、实验分组
• 三 光免疫细胞化学检测PCNA、LC3 表达
• 四 Western-Blot 检测LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、PCNA 蛋白的表达
• 五 统计学处理
• 结果
• 1 自噬对VSMC 增殖的影响
• 2 增殖因素（F2）对VSMC 自噬与增殖的影响
• 3 自噬抑VSMC 增殖的机制研究
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 自噬与动脉粥样硬化的关系
• 参考文献
• 攻读学位期间本人出版和公开发表的论著、论文
• 缩略词表（Abbreviation）
• 附图
• 致谢