原料乳中两种病原菌双重PCR检测方法的建立与应用

论文摘要

近年来，随着乳制品行业规模化生产的快速发展，由乳及乳制品的安全问题所引发的乳源性疾病，特别是细菌性食物中毒事件时有发生。因此，对乳源性病原菌的检测研究受到了前所未有的重视。大量研究结果表明金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）和致病性大肠杆菌（pathogenic Escherichia coli）是污染原料乳的两种最常见的人畜共患病病原菌，它们通过引发乳及乳制品的腐败变质，进而导致人畜共患病和人类食物中毒的发生。为此，加强原料乳及乳制品中金黄色葡萄球菌和致病性大肠杆菌的检测对预防和控制乳源性疾病的发生和流行显得至关重要。本研究在建立可同步检测金黄色葡萄球菌和致病性大肠杆菌的双重PCR方法的基础上，对合肥地区采集的新鲜原料乳以及市售乳制品进行上述两种病原菌检测，以期探明原料乳及乳制品的污染状况。首先，建立了检测金黄色葡萄球菌和致病性大肠杆菌的单一PCR方法。选取金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因和致病性大肠杆菌粘附素K99基因作为检测目的基因，根据nuc基因和K99基因的保守区序列，应用Primer5.0软件设计合成2对特异性引物。在其他因素不变的条件下，通过对引物浓度、模板浓度、退火温度和Mg2+浓度的摸索，确定了金黄色葡萄球菌单一PCR检测方法的最佳条件是：在25μL反应体系中加入10×PCR Buffer2.5μL，dNTPs0.5μL，Mg2+（25mM）1.5μL，DNA模板3.0μL，引物（20pmol）各0.5μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.3μL，双蒸水16.2μL。各成分混合后进行95℃预变性10min，94℃变性45s；58℃退火30s；72℃延伸30s，共循环30次，最后72℃后延伸5min。致病性大肠杆菌单一PCR检测方法的最佳条件是将退火温度降至56℃，其余条件同上。其次，建立了可同时检测金黄色葡萄球菌和致病性大肠杆菌的双重PCR方法。在单一PCR检测方法的基础上，采用正交试验对引物浓度、Mg2+浓度、模板浓度和退火温度在4个水平上进行L16（44）优化试验，确定了双重PCR方法的最佳条件为：25μL反应体系中，10×PCR Buffer2.5μL，dNTPs0.5μL，Mg2+（25mM）2.5μL，DNA模板终浓度比为1:1、引物终浓度比为1:3，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.3μL，双蒸水17.2μL，各反应物混合均匀后于95℃预变性10min，94℃变性45s；58℃退火30s；72℃延伸30s，共循环30次，最后72℃后延伸5min。再次，利用建立的双重PCR方法检测人工模拟样品，验证其实际应用的可行性。使用微孔滤膜过滤富集样品中的菌体后，采用改良DNA提取法抽提模板进行双重PCR检测。结果显示无需对样品进行培养，即可从富集后的样品中检测出目的基因。从样品的富集到PCR产物的检测，整个过程大约需要6h左右，且两种病原菌的最低检测限均达到102CFU/mL。表明建立的双重PCR方法具有较好的应用可行性。最后，采用建立的双重PCR方法对从合肥地区采集的152份新鲜原料乳和50份市售乳制品进行检测，同时以国标法进行对比验证。结果从50份市售乳制品中均未检测出两种病原菌。在所检测的152份新鲜原料乳中，双重PCR方法和国标法检出金黄色葡萄球菌的阳性率分别为75.00%和36.84%，致病性大肠杆菌的阳性率分别为47.37%和8.55%，同时检出两种病原菌的阳性率分别为38.16%和4.61%。两种方法检出金黄色葡萄球菌或致病性大肠杆菌的符合率分别为61.84%或61.18%，同时检出两种病原菌的符合率为66.45%。结果表明，该双重PCR方法灵敏度高、结果准确可靠、且无漏检现象。综上所述，本研究建立的同步检测金黄色葡萄球菌和致病性大肠杆菌的双重PCR方法特异性强、灵敏度高、检测周期短,可用于乳及乳制品中两种病原菌的快速检测。检测结果表明，合肥地区原料乳中金黄色葡萄球菌和致病性大肠杆菌的污染程度较高，应重视乳制品的质量安全问题。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 图表目录
• 本论文常用中英文缩写词
• 文献综述
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验菌株
• 1.1.2 主要培养基与试剂
• 1.1.3 实验动物
• 1.1.4 常用培养基及溶液配制
• 1.1.4.1 Baird-Parker培养基
• 1.1.4.2 50×TAE缓冲液（贮存液）
• 1.1.4.3 EB溶液
• 1.1.4.4 1.2%琼脂糖凝胶
• 1.1.4.5 50% Na2EDTA溶液
• 1.1.5 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 金黄色葡萄球菌单一PCR检测方法的建立
• 1.2.1.1 DNA模板提取
• 1.2.1.2 引物的设计与合成
• 1.2.1.3 PCR扩增体系与循环条件的优化
• 1.2.1.4 特异性测定
• 1.2.2 致病性大肠杆菌单一PCR检测方法的建立
• 1.2.2.1 DNA模板提取
• 1.2.2.2 引物的设计与合成
• 1.2.2.3 PCR扩增体系与循环条件的优化
• 1.2.2.4 特异性测定
• 1.2.3 双重PCR检测方法的条件优化与建立
• 1.2.3.1 双重PCR检测方法的建立与条件优化
• 1.2.3.2 特异性测定
• 1.2.3.3 敏感性测定
• 1.2.4 人工模拟样品中两种病原菌的双重PCR检测
• 1.2.4.1 原料乳的人工污染
• 1.2.4.2 人工污染乳的过滤
• 1.2.4.3 人工污染乳的双重PCR检测
• 1.2.5 原料乳及乳制品中两种病原菌污染情况的检测
• 1.2.5.1 样品的采集与保存
• 1.2.5.2 原料乳中两种病原菌的双重PCR检测
• 1.2.5.2.1 原料乳DNA模板制备
• 1.2.5.2.2 双重PCR检测
• 1.2.5.3 原料乳中两种病原菌的分离与鉴定
• 1.2.5.3.1 金黄色葡萄球菌的分离和鉴定
• 1.2.5.3.2 致病性大肠杆菌的分离和鉴定
• 1.2.5.3.3 大肠杆菌的致病性检测
• 1.2.5.4 市售乳制品中两种病原菌的双重PCR检测
• 2 结果与分析
• 2.1 金黄色葡萄球菌单一PCR检测方法的建立
• 2.2 致病性大肠杆菌单一PCR检测方法的建立
• 2.3 双重PCR检测方法的条件优化与建立
• 2.3.1 双重PCR检测方法的建立与条件优化
• 2.3.2 特异性测定
• 2.3.3 敏感性测定
• 2.4 人工模拟样品中两种病原菌的双重PCR检测
• 2.5 原料乳及乳制品中两种病原菌污染情况的检测
• 2.5.1 原料乳中两种病原菌的双重PCR检测结果
• 2.5.2 原料乳中两种病原菌的分离鉴定结果
• 2.5.2.1 金黄色葡萄菌的分离鉴定结果
• 2.5.2.2 致病性大肠杆菌的分离鉴定
• 2.5.3 双重PCR检测方法和国标法的比较
• 2.5.4 乳制品中两种病原菌的双重PCR检测结果
• 3 讨论
• 3.1 双重PCR检测方法的条件优化
• 3.2 原料乳中DNA模板提取方法
• 3.3 双重PCR检测方法的灵敏性与准确性
• 3.4 原料乳及市售乳制品中两种病原菌的污染情况
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介