血管生成素与磷脂混杂酶1相互作用及其功能研究

论文摘要

血管生成素（Angiogenin,ANG）能够促进血管新生和肿瘤增殖,然而作用机制未明。由于蛋白质相互作用在生命活动中扮演关键角色,研究ANG相互作用蛋白质将是阐明其作用机制的有效途径。酵母双杂交技术是目前被普遍采用的高通量筛选相互作用蛋白质的方法之一。在前期工作中,本实验室已经成功地用酵母双杂交法从人心肌cDNA文库筛选到22个与ANG存在相互作用的蛋白质。考虑到肝脏是ANG的主要合成脏器,也为了发现更多的ANG相互作用蛋白质,本论文再次利用酵母双杂交方法对人肝cDNA文库进行了筛选,并获得了8个能够与ANG在酵母细胞中发生相互作用的蛋白质,其中有4个与从心肌cDNA文库中筛选到的蛋白质一致。这些与血管生成素有潜在相互作用的新蛋白的发现,扩充了实验室前期发现的血管生成素相互作用蛋白数据库,为探索血管生成素作用机制提供了新的线索。磷脂混杂酶1（phospholipid scramblase 1,PLSCR1）是此次筛选到的ANG相互作用蛋白之一。它是一个Ⅱ型膜蛋白,最初因其磷脂混杂酶活性而得名。近年来的研究发现PLSCR1能够转位到细胞核内,但其在细胞核内行使的生物学功能尚不明确。酵母双杂交系统显示的相互作用蛋白还需要利用其它研究蛋白质相互作用的方法进一步验证。因此,我们首先采用体外GST沉降（GST-pull down）以及体内免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）技术证明了PLSCR1与ANG相互作用的真实性。为了进一步了解PLSCR1在细胞内的定位以及与ANG的共定位情况,我们用荧光蛋白CFP和YFP分别标记PLSCR1和ANG,通过转染方法在HeLa细胞内实现高表达后,用激光共聚焦显微镜进行观察。结果显示,融合蛋白CFP-PLSCR1和YFP-ANG明显地共定位于细胞核。经FRET分析证实,两者能够在细胞核内发生相互作用。此外,为排除标签蛋白CFP和YFP对目标蛋白定位的影响,我们采用间接免疫荧光方法以及细胞核免疫共沉淀的方法检测到不带荧光蛋白标签的PLSCR1与ANG也能够在细胞核内共定位并发生相互作用。已知细胞核内的ANG具有促进rRNA转录的活性;ANG的核转位及其促rRNA转录活性是ANG诱导细胞增殖和血管新生的基础。然而到目前为止,ANG在细胞核内促进rRNA转录以及调节ANG促rRNA转录过程的分子机制均未明了。基于PLSCR1能够与ANG在细胞核内发生相互作用,我们进一步检测了PLSCR1对ANG促进的rRNA转录活性的影响。结果显示,在HeLa细胞内,PLSCR1水平与rRNA的转录水平呈正相关,且过表达PLSCR1引起的rRNA转录活性增加必须依赖于细胞内ANG的存在。因而,我们认为PLSCR1能够增强ANG促进的rRNA转录活性。基于以上研究结果,我们得出如下结论:1.颗粒蛋白（granulin,GRN）、纤黏连蛋白1（fibronectin 1,FN 1）、内质网降解途径相关的泛素连接酶HRD1（ERAD-associated E3 ubiquitin-protein ligaseHRD1）、血管内皮紧张素（vascular endothelial statin,VE-statin）、潜在型TGF-β结合蛋白3（latent transforming growth factor beta binding protein 3,LTBP3）、磷脂混杂酶1、Sprouty1（Spry1）和脊索蛋白（chordin,CHRD）等是用酵母双杂交技术从人肝cDNA文库中筛选到的8种潜在的ANG相互作用蛋白质。2.PLSCR1是ANG在HeLa细胞中的相互作用蛋白质。3.PLSCR1与ANG的相互作用可以发生在HeLa细胞的细胞核内。4.在HeLa细胞内,PLSCR1可以正向调节ANG促进的rRNA转录。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语
• 目次
• 1 前言
• 2 主要仪器设备、材料与试剂
• 2.1 主要仪器设备
• 2.2 主要耗材
• 2.3 细胞、细菌及其培养液
• 2.4 主要试剂
• 2.5 缓冲液和溶液等的配制
• 3 酵母双杂交筛选血管生成素相互作用蛋白质
• 3.1 导言
• 3.2 原理和技术路线
• 3.3 实验方法
• 3.4 实验结果
• 3.5 讨论
• 4 血管生成素与磷脂混杂酶1相互作用研究
• 4.1 导言
• 4.2 原理和技术路线
• 4.3 PLSCR1与ANG相互作用真实性验证
• 4.3.1 实验方法
• 4.3.2 实验结果
• 4.4 PLSCR1与ANG在细胞核内相互作用
• 4.4.1 实验方法
• 4.4.2 实验结果
• 4.5 PLSCR1对ANG促进的rRNA转录的调节作用
• 4.5.1 实验方法
• 4.5.2 实验结果
• 4.6 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 综述一
• 综述二
• 作者简历及在学期间所取得的科研成果