辣椒疫霉（Phytophthora capsici）诱导坏死蛋白基因克隆及功能研究

论文摘要

辣椒疫病是在世界范围内普遍发生的一种毁灭性病害,能侵染多种茄科及葫芦科植物。最早在1922年,Leon Leonian记载了发生在墨西哥辣椒疫病,确定其病原为Phytophthora capsici.病原物的成功侵染必须克服寄主的防卫系统,进而获取养分进行繁殖扩大侵染。卵菌病原物能够分泌效应蛋白,引起寄主生理变化,破坏寄主防御系统。NPP（Necrosis-inducing Phytophthora Protein）,也被称为Nep-1 like proteins是一种典型的效应蛋白。许多真菌细菌及卵菌都可以产生诱导坏死蛋白,特别是卵菌中的疫霉属基因组存在大量的诱导坏死基因。植物受NPP处理表现为乙烯释放,MAP激酶活化,植保素合成,PR基因诱导表达,胞质Ca2+释放等防御反应。NPP蛋白能够诱导多种双子叶植物产生过敏反应。NPP蛋白可能在病原微生物中作为毒蛋白,而在一些腐生生物里具备非毒性功能。但是目前对NPP蛋白功能尚不清楚,本研究主要对辣椒疫霉诱导坏死蛋白基因家族功能进行研究,探索其在疫霉侵染过程作用机制。本研究对辣椒疫霉菌株SD33内NPP基因家族的致病遗传机制及其功能进行了分析。具体内容如下:（1）对辣椒疫霉高致病性菌株SD33内NPP蛋白基因克隆并进行生物信息学分析。首先对辣椒疫霉基因组序列进行生物信息学分析,特别分析了基因组内NPP基因家族信息。以高致病辣椒疫霉菌株SD33为材料,利用同源序列法克隆了该菌株内18个NPP基因并进行BLAST分析;在利用DNAman软件对克隆的序列进行比对,发现辣椒疫霉的NPP蛋白基因序列长度都在400– 1000 bp,并且都有严格保守的‘GHRHDWE’基序,以及C-端相对保守序列‘QDLIMWDQ’.（2）分析了18个NPP基因在菌体内的表达模式并进行系统进化分析。根据18个基因序列,设计特异引物借助RT-PCR分析了菌丝生长阶段基因家族不同基因的表达模式。结果发现有12个基因在菌丝生长阶段具有活性;同时下载不同物种的同源基因借助PAUP* 4.0软件进行了系统进化分析,结果显示所有来自卵菌的NPP基因都能聚成一支,而细菌和真菌的NPP基因却不能严格分支,说明NPP基因是卵菌基因组特有的标志,适合用于卵菌进化分析。（3）辣椒疫霉NPP基因在植物体内的功能分析。选择了12个基因为研究对象,分别构建了PVX表达载体,然后转化农杆菌进行瞬时表达。利用农杆菌侵染法接种烟草和辣椒幼苗。记录每个基因表达后所引起两种植物症状变化。结果显示辣椒和烟草的症状不同,并且各个基因成员在同一种植物上表达后的症状也是大相径庭;其中接种烟草的叶片大多出现坏死,黄化症状,个别基因接种没有引起植物防卫反应;而接种的辣椒叶片除了产生上述症状外,个别基因（Pcnpp7和Pcnpp8）的表达还出现了皱缩和卷曲症状。这说明了NPP家族成员基因功能的多样性,辣椒疫霉NPP基因可能还具备其它一些新的功能。（4）辣椒疫霉Pcnpp1潜在活性位点基因体外突变及其突变体在烟草及辣椒中的瞬时表达。根据已报道的同源NPP蛋白结构,预测该基因可能有4个潜在活性位点（D112, H120, D123, E125）,利用OverLap PCR将4个活性位点分别进行定点突变（D112A, H120A, D123A, E125A ）以及4个活性位点同时突变（112/120/123/125A）。并设计引物为这5个突变体分别构建PVX载体（PGR106）,并利用冻融法转化农杆菌GV3101。然后接种烟草辣椒叶片,发现突变体都不能引起叶片坏死或者黄化。说明该基因所选择的4个氨基酸是该蛋白的活性位点,该蛋白可能具备酶活性,是一类具有酶活性的效应蛋白,但是具体底物未知。（5）辣椒疫霉NPP基因在病原寄主互作过程中表达模式分析。用游动孢子悬浮液接种离体辣椒叶片,在接种后1d, 3d, 5d, 7d取样然后提取发病叶片总RNA。反转录后用荧光定量PCR分析了12个候选基因在疫霉侵染过程中的表达模式。实验结果显示表达模式分两种情况。即Pcnpp1, Pcnpp2, Pcnpp6, Pcnpp9和Pcnpp10的表达模式基本一致,其表达量在侵染初期成上升趋势,都在第3 d的表达量最高;而Pcnpp3, Pcnpp5, Pcnpp7, Pcnpp8, Pcnpp13, Pcnpp14和Pcnpp15表达量在整个侵染过程成上升趋势,在侵染后期达到峰值。这说明NPP蛋白在病原侵染的整个阶段都表达,病原与植物防御系统间的反应不仅局限于侵染初期,还可能持续整个侵染过程。辣椒疫霉诱导坏死基因家族的成员分别在不同的侵染时期参与克服植物防御反应,在致病过程中起到重要作用。（6）借助PEG介导的原生质体转化方法,得到了7个沉默突变体菌株,实现了10个候选基因的沉默。根据各基因序列设计基因特异性引物及载体pHAM34酶切位点,构建了12个候选基因的沉默表达载体。将重组质粒及标记质粒pHspNpt转入辣椒疫霉SD33原生质体,利用抗生素G418筛选转化子。得到的转化子在V8培养基上生长并记录生物性状,包括菌丝生长速率、菌丝形态、游动孢子产率等等。同时提取转化子菌体总RNA,反转录后,荧光定量PCR分析各候选基因在各转化子内的沉默效率。结果显示,7个转化子中除了Pcnpp6和Pcnpp8外,其余10个基因的沉默效率都在80%以上,并且出现了多个基因在同一个转化子内共沉默的现象,这可能是相关基因同源性较高,发生了染色体异染色质化的原因。此外基因沉默并没有引起疫霉菌株生物性状的变化。（7）对转化子的致病性进行了检测,利用游动孢子接种方法处理辣椒幼苗叶片,以野生型菌株为对照,记录叶片发病情况及病斑大小。分析结果发现沉默突变体的致病力明显降低,表现为症状产生时间延缓并且病斑面积明显变小。说明NPP基因沉默导致菌株致病力降低,NPP在病原侵染过程中起到重要作用。综合所有实验结果,我们认为辣椒疫霉诱导坏死基因是以基因家族形式存在的,在寄主病原互作过程中扮演着重要角色。NPP基因是卵菌,特别是疫霉菌的一个典型特征。辣椒疫霉诱导坏死基因不仅能使植物产生常见的坏死,萎蔫等症状,还会引起寄主叶片皱缩坏死。基因家族各成员的功能存在差异,即使同源性很高的基因基因之间也可能存在显著的功能差异,对基因家族功能的研究不能局限于个别基因功能的分析。NPP蛋白可能是一种具备酶活性的效应蛋白,或者可能是一种毒蛋白,但是具体作用底物还是未知的。NPP基因沉默不会引起菌株表型变化但会导致转化子致病力明显降低。此外很难实现基因家族单一成员或者全部成员基因沉默,但是并不影响对该类基因功能的分析。将该家族10个基因进行稳定沉默,进行致病性测定分析发现该家族部分成员沉默会导致菌株致病性明显降低。利用稳定基因沉默对于基因家族成员功能的研究是个很好的选择。

论文目录

符号说明

中文摘要

Abstract

1 文献综述

1.1 辣椒疫病发生与防治研究进展

1.1.1 辣椒疫病的发生危害

1.1.2 辣椒疫病发生规律和发病条件

1.1.3 辣椒疫霉及其生物学特性

1.1.4 辣椒疫霉的生理分化

1.1.5 辣椒疫病的防治

1.1.5.1 农业防治

1.1.5.2 化学防治

1.1.5.3 生物防治

1.2 植物病原真菌致病基因的研究现状

1.2.1 与侵染结构产生有关的基因

1.2.2 与角质层及细胞壁降解有关的基因

1.2.3 真菌毒素类

1.2.4 与信号传导有关的基因

1.2.5 与寄主代谢反应相关的基因

1.2.6 其它致病基因

1.3 辣椒疫病的抗性遗传与抗病基因研究进展

1.3.1 辣椒对疫病的抗性特点

1.3.2 抗疫病基因的分子标记与 QTL 定位

1.4 卵菌效应蛋白研究进展

1.4.1 无毒基因（Avr）

1.4.2 毒素

1.4.2.1 NPP 蛋白

1.4.2.2 PcF/ScR 蛋白

1.4.2.3 CRN 蛋白

1.4.2.4 水解酶以及水解酶抑制子（hydrolase, hydrolase inhibitors）

1.4.2.5 蛋白酶抑制子（Proteinase inhibitors）

1.4.2.6 葡聚糖酶抑制子（Glucanase inhibitor）

1.5 NPP（NEP1-like protein）效应子研究进展

1.5.1 NPP 的发现与存在

1.5.2 NPP 蛋白的活性

1.5.3 NPP 基因结构

1.5.4 植物对 NPP 的防卫反应

1.5.5 NPP 蛋白致病功能研究

1.6 农杆菌介导的基因瞬时表达体系

1.6.1 瞬时表达的优点

1.6.2 农杆菌瞬时表达的原理

1.6.3 PVX 表达载体

1.7 基因沉默技术

1.7.1 转录水平的基因沉默

1.7.2 转录后水平的基因沉默

1.7.3 基因沉默原因

1.7.3.1 DNA 甲基化（DNA methylation）

1.7.3.2 重复序列

1.7.3.3 同源序列

1.7.3.4 位置效应（position effect）

1.7.3.5 共抑制现象（co-suppression）

1.7.3.6 反义RNA

1.8 卵菌基因沉默研究进展

1.8.1 卵菌沉默机制

1.8.2 卵菌稳定沉默

1.8.3 卵菌瞬时基因沉默

1.8.4 基因沉默与表型变化的关系

1.9 卵菌转化技术的进程与挑战

1.9.1 卵菌转化技术研究进展

1.9.2 卵菌转化载体系统

1.9.3 选择性标记

1.9.4 原生质体转化（protoplast transformation）

1.9.5 农杆菌转化（agrobacterium-mediated transformation）

1.9.6 粒子轰击方法转化（transformation by bombardent）

1.9.7 电转化（electroporation）

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 辣椒疫霉菌株

2.1.2 菌株与质粒

2.1.3 酶和生化试剂

2.1.4 仪器

2.1.5 培养基

2.1.6 溶液配制

2.2 实验方法

2.2.1 辣椒疫霉基因组内诱导坏死蛋白（NPP）基因信息分析

2.2.2 辣椒疫霉菌株 SD33 诱导坏死蛋白（ PCNPP）基因家族成员克隆

2.2.2.1 基因克隆引物设计

2.2.2.2 辣椒疫霉 DNA 提取

2.2.2.3 PcNPP 基因克隆

2.2.3 辣椒疫霉菌株 SD33 诱导坏死蛋白（ PCNPP）基因家族系统进化分析

2.2.4 辣椒疫霉菌株 SD33 诱导坏死蛋白（ PCNPP）基因家族成员在菌丝体内表达

2.2.4.1 辣椒疫霉菌株SD33 总RNA 的提取和cDNA 的合成

2.2.4.2 紫外检测RNA 产率和纯度

2.2.4.3 反转录cDNA 第一链的合成

2.2.4.4 RT-PCR

2.2.5 辣椒疫霉菌株 SD33 诱导坏死蛋白（PCNPP）基因家族成员在病原寄主互作过程中表达模式分析

2.2.5.1 接种辣椒叶片

2.2.5.2 受试辣椒叶片总 RNA 的提取（Trizol 法）

2.2.5.3 RNA 紫外检测反转录

2.2.5.4 荧光定量 PCR

2.2.6 辣椒疫霉菌株 SD33 诱导坏死蛋白（ PCNPP）基因在植物体内瞬时表达

2.2.6.1 农杆菌瞬时表达载体构建引物设计

2.2.6.2 辣椒疫霉诱导坏死蛋白PVX 表达载体构建

2.2.6.3 辣椒疫霉诱导坏死蛋白PVX 表达载体农杆菌转化

2.2.6.4 辣椒疫霉诱导坏死蛋白PVX 表达载体接种辣椒和烟草

2.2.7 基因PcNPP1 活性位点定点突变

2.2.7.1 PcNPP1 活性位点定点突变引物设计

2.2.7.2 PcNPP1 活性位点定点突变基因PVX 载体构建

2.2.7.3 PcNPP1 定点突变基因接种烟草辣椒

2.2.8 辣椒疫霉菌株 SD33 诱导坏死蛋白（PCNPP）基因稳定沉默

2.2.8.1 卵菌稳定转化载体构建引物设计

2.2.8.2 辣椒疫霉诱导坏死蛋白稳定沉默表达载体构建

2.2.8.3 辣椒疫霉诱导坏死蛋白稳定沉默重组载体质粒提取

2.2.8.4 辣椒疫霉菌转化步骤

2.2.9 辣椒疫霉基因沉默转化子的筛选和分子验证

2.2.9.1 辣椒疫霉PCNPP 基因沉默转化子RT-PCR 分析

2.2.9.2 辣椒疫霉PCNPP 基因沉默转化子荧光定量PCR 分析

2.2.10 辣椒疫霉 PCNPP 基因沉默转化子筛选及其生物学性状分析

2.2.10.1 游动孢子诱导

2.2.10.2 转化子表型分析

2.2.10.3 致病性测定

3 结果与分析

3.1 辣椒疫霉基因组信息分析结果

3.2 辣椒疫霉 PCNPP 基因克隆

3.2.1 辣椒疫霉坏死诱导蛋白pcnpp1 基因的克隆及其序列分析

3.2.2 辣椒疫霉坏死诱导蛋白pcnpp2 基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析

3.2.3 辣椒疫霉坏死诱导蛋白pcnpp3 基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析

3.2.4 辣椒疫霉坏死诱导蛋白pcnpp4 基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析

3.2.5 辣椒疫霉坏死诱导蛋白pcnpp5 基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析

3.2.6 辣椒疫霉坏死诱导蛋白pcnpp6 基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析

3.2.7 辣椒疫霉坏死诱导蛋白pcnpp7 基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析

3.2.8 辣椒疫霉坏死诱导蛋白pcnpp8 基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析

3.2.9 辣椒疫霉坏死诱导蛋白pcnpp9 基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析

3.2.10 辣椒疫霉坏死诱导蛋白pcnpp10 基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析

3.2.11 辣椒疫霉坏死诱导蛋白pcnpp11 基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析

3.2.12 辣椒疫霉坏死诱导蛋白pcnpp12 基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析

3.2.13 辣椒疫霉坏死诱导蛋白pcnpp13 基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析

3.2.14 辣椒疫霉坏死诱导蛋白pcnpp14 基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析

3.2.15 辣椒疫霉坏死诱导蛋白pcnpp15 基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析

3.2.16 辣椒疫霉坏死诱导蛋白pcnpp16 基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析

3.2.17 辣椒疫霉坏死诱导蛋白pcnpp17 基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析

3.2.18 辣椒疫霉坏死诱导蛋白pcnpp18 基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析

3.3 辣椒疫霉PCNPP 基因系统进化分析

3.3.1 18 个PcNPP 基因序列比对

3.3.2 辣椒疫霉PcNPP 基因系统进化分析

3.4 PcNPP 基因在辣椒疫霉菌体内体表达分析

3.5 PcNPP 基因在辣椒疫霉与寄主互作中表达模式分析

3.6 PcNPP 基因农杆菌瞬时表达

3.6.1 PcNPP 基因PVX 载体构建及农杆菌转化

3.6.2 PcNPP 基因农杆菌转化子在辣椒体内瞬时表达

3.6.3 PcNPP 基因农杆菌转化子在烟草体内瞬时表达

3.7 PcNPP1 基因体外突变

3.7.1 PcNPP1 基因活性位点突变

3.7.2 PcNPP1 基因活性位点突变后农杆菌瞬时表达

3.8 辣椒疫霉诱导坏死蛋白 PcNPP 基因稳定沉默突变体的获得

3.9 辣椒疫霉诱导坏死蛋白 PcNPP 沉默转化子表型分析

3.10 辣椒疫霉诱导坏死蛋白PcNPP 沉默转化子致病性测定

4 结论与讨论

4.1 辣椒疫霉基因组信息分析

4.2 辣椒疫霉诱导坏死基因确定

4.3 辣椒疫霉12 个诱导坏死基因在病原与寄主互作过程中表达模式异同

4.4 辣椒疫霉12 个诱导坏死基因 PVX 表达后农杆菌接种症状差异

4.5 辣椒疫霉诱导坏死基因沉默

4.6 辣椒疫霉 PcNPP 基因沉默突变体致病力降低

参考文献

附录

致谢

攻读博士学位期间发表文章

博士学位论文内容简介及自评

辣椒疫霉（Phytophthora capsici）诱导坏死蛋白基因克隆及功能研究

论文摘要

论文目录

相关论文文献

猜你喜欢