论文摘要
第一部分外周血单个核细胞miR-27a-3p诊断胰腺癌的效能评价目的：研究已显示miRNA在多种癌症诊断中具有重要的潜在应用价值。本研究拟从外周血单个核细胞中探寻可能的差异表达miRNA用于胰腺癌的诊断。方法：共纳入三组队列,分别为胰腺癌组（PC）、胰腺及胰周良性疾病组（BPD）及正常对照组,共352例外周血单个核细胞样本。首先应用测序技术从外周血单个核细胞中鉴定出PC组与BPD组、正常对照组之间的差异表达miRNA（每组20例）。继在另外292例外周血单个核细胞样本中,利用RT-PCR技术验证测序技术鉴定出的差异miRNA。最后应用Logistic回归模型及受试者工作特征曲线（AUC）评估差异表达miRNA预测胰腺癌的价值。结果：外周血单个核细胞miR-27a-3p可以有效从BPD中鉴别出PC,敏感性及特异性分别为82.2%及76.7%（AUC=0.840;95%CI,0.787-0.885）。由外周血单个核细胞miR-27a-3p与血清CA19-9联合建立的Logistic回归模型可进一步提高胰腺癌诊断效能,相应的敏感性及特异性分别为85.3%及81.6%（AUC=0.886;95%CI,0.837-0.923）。该联合诊断模型在不同分期的胰腺癌诊断中均有较佳效能,诊断Ⅰ期、Ⅱ期及Ⅲ期胰腺癌的AUC分别为0.881、0.884及0.893。结论：外周血单个核细胞miR-27a-3p可能成为一种新的胰腺癌潜在诊断标志物,与血清CA19-9建立联合诊断模型可提高胰腺癌诊断效能,可能具有一定临床应用价值。第二部分iTRAQ标记蛋白组学揭示胰腺癌患者预后相关蛋白MYOF目的：胰腺癌组织分化是与胰腺癌患者预后密切相关的重要病理参数,因此从胰腺癌组织不同分化背景中的分子标签中就可能筛选出影响胰腺癌恶性程度的关键蛋白。本研究旨在鉴定可能影响胰腺癌患者预后的蛋白标志物。方法：应用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）联合串联质谱技术鉴定不同分化胰腺癌组织之间差异表达蛋白。共取自40例胰腺癌患者的60份外科切除新鲜组织标本用于本蛋白质组学研究中。蛋白免疫印迹及免疫组织化学检测用于对鉴定的差异蛋白作进一步验证。结果：两次独立的iTRAQ联合串联质谱实验共重复鉴定出1623种蛋白。根据我们所设立的筛选标准共鉴定出15种差异表达蛋白,其中上调蛋白10种,下调蛋白5种。Myoferlin蛋白（MYOF）被选择应用蛋白免疫印迹作进一步验证。对另外154例胰腺癌石蜡标本进行免疫组织化学分析显示,MYOF表达与胰腺癌分化程度显著相关（P=0.004）。单变量及多变量分析表明MYOF是行外科根治术胰腺癌患者生存预后的独立预测因子（HR,1.540；95%CI,1.061-2.234；P=0.023）。结论：iTRAQ联合串联质谱蛋白质组学研究揭示胰腺癌组织MYOF在胰腺癌患者生存预后预测中的重要价值。第三部分MYOF基因沉默对胰腺癌细胞生物学特性的影响目的：构建MYOF基因的siRNA载体,并评价MYOF基因沉默对胰腺癌细胞生长、增殖、迁移、周期、凋亡及成瘤能力的影响。方法：首先设计针对MYOF mRNA不同位点的特异性siRNA序列,合成含干扰序列的单链DNA oligo,然后退火配对产生双链,再通过其两端所含酶切位点直接连入酶切后的RNAi慢病毒载体上；将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞,PCR鉴定阳性重组子后,送测序验证,测序结果经比对确认正确后,进行质粒抽提,并转染293T细胞进行病毒包装；最后用病毒感染胰腺癌细胞,RT-PCR检测MYOF沉默效果。在获取稳定的MYOF基因沉默的胰腺癌细胞株后,通过MTT、克隆形成实验、Transwell实验、细胞周期及凋亡实验、裸鼠体内成瘤实验等评估MYOF基因沉默对胰腺癌细胞生长、增殖、迁移等生物学功能的影响。结果：本实验成功构建MYOF基因的siRNA’慢病毒载体；病毒包装及胰腺癌细胞感染后,应用RT-PCR检测显示MYOF基因沉默效果较好；成功获取MYOF基因表达下调的BXPC-3及CFPAC-1胰腺癌细胞株。MTT实验、Transwell实验结果分别表明沉默MYOF基因可抑制胰腺癌细胞系的增殖能力、细胞迁移能力。克隆形成实验及裸鼠体内成瘤实验结果表明沉默MYOF基因可抑制胰腺癌细胞系的成瘤能力。流式细胞学实验则证实沉默MYOF基因后胰腺癌细胞系的凋亡比例明显提高,细胞S期阻滞明显增加,G2期细胞比例明显下降。结论：本实验设计siRNA序列能够有效下调BXPC-3及CFPAC-1胰腺癌细胞系中的MYOF基因表达。MYOF基因沉默显著抑制BXPC-3及CFPAC-1胰腺癌细胞系的生长、增殖、迁移、及成瘤能力,且显著改变细胞周期循环及促进凋亡形成。
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