12-脂氧化酶对糖尿病肾病肾小球肥大的机制研究

论文摘要

糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病患者最常见的微血管并发症之一也是导致糖尿病患者心血管事件增加率及其死亡率上升的主要原因。国外终末期肾衰竭患者中原发病为糖尿病的约占总数的30%-40%。随着我国糖尿病患者人数的日益增多,目前DN已跻身为我国导致慢性肾病能不全的重要原因之一。DN起病隐匿,且病程进展迅速,一旦患者确诊为DN时往往已经处于不可逆的肾脏损害并进入快速发展的阶段。DN临床治疗效果不理想、预后差成为当前临床医生面临的一个重大难题。众所周知,DN早期特征性的病理改变为肾小球肥大及细胞外基质增多,随着病情逐渐进展,进而出现肾小球硬化及间质纤维化,临床表现为慢性肾功能不全。早期DN是可以逆转的,因此,如何尽早明确糖尿病患者发展为DN的可能性,并采取有效的干预措施,延缓病变的发展是当前医学界研究热点。12-脂氧化酶（12-lipoxygensae,12-LO）是一种不饱和脂肪酸的氧化酶,在体内活化后以花生四烯酸（Arachidonic acid, AA）为基质生产12-氢氧化二十碳四烯酸（12-Hydroxyeicosatertraenioc acid,12（S）-HETE）的代谢产物。研究表明,12-LO及其代谢产物12（S）-HETE主要通过氧化应激及引起炎症反应参加多种疾病的发生、发展,如高血压、冠心病、糖尿病、动脉粥样硬化等。因此,12-LO及其代谢途径受到越来越多研究者的关注。早在1999年,Bleich D等人就发现：12-LO基因敲除的C57BL／6小鼠连续腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin, STZ） 5天,12-LO基因敲除的C57BL／6小鼠的血糖无明显升高。近年,Kim YS和Kang等研究发现高糖刺激后的肾小球系膜细胞12-HETE的释放水平是明显增加,而Reddy MA等人研究发现12-LO能够通过P38MAPK信号传导途径增加DN时细胞外基质（extracellular matrix, ECM）蛋白的表达,如：纤维连接蛋白（fibronectin, FN）、胶原蛋白（Collagen）,因此,12-LO在糖尿病肾病的发生、发展中具有重要的作用。肾小球肥大和细胞外基质增多是早期DN特征性的病理改变,而肾小球肥大与细胞周期调节有关的细胞周期素激酶抑制剂（cyclin-dependent kinase inhibitor, CKI）的表达密切相关。因此,本研究主要是多角度探讨DN时12-LO及其代谢途径与CKI表达调节及与肾小球细胞肥大的关系；观察积聚的细胞外基质（Extracellular matrix, ECM）对12-LO和CKI表达的调节作用,并阐明其分子机制,明确12-LO对DN肾小球细胞肥大的发生和ECM积聚的关系,进一步明确12-LO在DN进展中的作用,为临床治疗DN提供新的治疗靶点。我们以体外培养的原代肾小球系膜细胞、微型泵注射12（S）-HETE大鼠模型及高脂饮食结合小剂量的链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）诱发的2型糖尿病模型大鼠作为研究对象,进行如下实验：①微型泵注射12（S）-HETE对正常大鼠肾小球内CKI及ECM的表达影响；②皮下注射12-LO抑制剂（（cinnamyl-3,4-dihydroxy-cyanocinnamate,CDC）对2型糖尿病大鼠肾小球肥大及肾小球内CKI.ECM的表达影响；③12（S）-HETE刺激肾小球系膜细胞对CKI的表达影响及其信号传导；④高糖刺激肾小球系膜细胞对CKI的影响及给予CDC后CKI的表达变化；⑤模拟ECM微环境对肾小球系膜细胞CKI的表达影响和CDC对其表达的变化及其信号传导。主要研究结果如下：1.泵注射12（S）-HETE增加正常大鼠肾小球内P21、P16及CollagenⅣ的表达p<0.01）,而对正常大鼠血糖无明显影响。2.2型糖尿病大鼠肾脏肥大指数及肾小球体积较正常对照组大鼠明显升高p<0.01),CDC在不影响糖尿病大鼠的血糖的情况下,改善肾脏肥大及降低肾小球体积p<0.05)。3.2型糖尿病大鼠肾小球内12（S）-HETE水平明显升高（p<0.01）,P21、P16及CollagenⅣ的表达也明显增加（p<0.01）；给予CDC治疗后P21、P16及CollagenⅣ的表达和12（S）-HETE水平均显著下降p<0.05).P38MAPK活性与12（S）-HETE水平变化一致。4.12（S）-HETE使系膜细胞内P21、P16表达显著增加（p<0.01）,给予P38MAPK抑制剂后,P21、P16的表达明显降低（p<0.05）。5.高糖刺激使系膜细胞释放12（S）-HETE水平增加（p<0.01）,CDC降低高糖刺激后系膜细胞12（S）-HETE释放水平（p<0.05）。6.高糖刺激使系膜细胞内P21、P16的表达明显增加（p<0.01）,CDC降低高糖刺激引起的P21、P16的表达（p<0.05）。7.模拟的ECM微环境使系膜细胞释放12（S）-HETE水平增加p<0.01),CDC降低模拟的ECM微环境中的系膜细胞12（S）-HETE释放水平（p<0.05）。P38MAPK活性与12（S）-HETE水平变化一致。8.模拟的ECM微环境能够明显增加系膜细胞内P21、P16的表达（p<0.01）,给予CDC后,P21、P16的表达显著降低（p<0.05）。根据以上结果得出的以下结论：1.泵注射12-LO代谢产物12（S）-HETE上调正常大鼠肾小球内细胞周期素激酶抑制剂P21、P16及细胞外基质蛋白CollagenⅣ的表达。2.2型DN大鼠肾小球内细胞周期素激酶抑制剂P21、P16及细胞外基质蛋白CollagenⅣ的表达显著升高,而12-LO特异性抑制剂CDC在不影响2型糖尿病大鼠模型的血糖的情况下,能够明显降低周期素激酶抑制剂P21、P16及细胞外基质蛋白CollagenⅣ的表达。3.12（S）-HETE刺激上调MCs内细胞周期素激酶抑制剂P21、P16的表达,给予P38MAPK抑制剂后,P21、P16的表达明显下降,提示12-LO通过P38MAPK信号传导调节P21、P16的表达,至少部分通过该途径介导的。4.高糖刺激增加MCs释放12（S）-HETE水平,同时上调细胞周期素激酶抑制剂P21、P16的表达,给予CDC后,P21、P16的表达明显降低,表明糖尿病肾病时,高血糖至少可以通过增加12-LO的活性促进DN的发生、发展。5.模拟的ECM微环境上调MCs内细胞周期素激酶抑制剂P21、P16的表达及增加P38MAPK活性,给予12-LO特异性抑制剂CDC后,P21、P16的表达及P38MAPK的活性明显降低；2型DN时,12-LO能够增加ECM蛋白的表达,由此我们可以看出增加的ECM蛋白可以进一步增加12-LO的活性参与DN的发病过程。上述结果说明,ECM参与12-LO-P38PAMK途径介导与肾小球细胞肥大相关的P21、P16的表达。综上所述,本研究进一步说明了DN时肾小球肥大与ECM积聚并不是相互独立的病理变化,二者之间存在一定的相互关联。此研究不仅探讨了12-LO在肾小球肥大中的作用,而且对其信号传导途径进行了充分的研究,同时体外实验模拟体内微环境进一步将ECM和CKI及12-LO联系起来,进一步研究12-LO在DN的发展中的作用,为今后临床实验提供理论依据。本研究的创新点在于把两个病理改变联系一起,同时体外人为模拟体内环境研究12-LO在两者之间的作用,进一步完善12-LO在DN发病过程中的作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 绪论
• 第1章 文献综述
• 1.1 糖尿病肾病发病机制
• 1.2 细胞周期及细胞周期的调控蛋白
• 1.3 细胞周期的调控与糖尿病肾病
• 1.4 P21在细胞周期调控中的作用
• 1.5 P16在细胞周期调控中的作用
• 1.6 P21和P16与糖尿病肾病的关系
• 1.7 细胞外基质与糖尿病肾病的关系
• 1.8 12-脂氧化酶与糖尿病肾病的关系
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 原代系膜细胞系
• 2.1.2 实验动物
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 体内实验
• 2.2.2 体外实验
• 2.2.3 统计学分析
• 第3章 结果
• 3.1 体内实验
• 3.1.1 动物实验（一）
• 3.1.1.1 实验动物的一般情况
• 3.1.1.2 泵注射12（S）-HETE对大鼠体重、血糖、尿蛋白、肾脏肥大指数的影响
• 3.1.1.3 泵注射12（S）-HETE对大鼠肾小球内P21、P16的表达及P38MAPK活性的影响
• 3.1.1.4 泵注射12（S）-HETE对大鼠肾小球内CollagenⅣ表达的影响
• 3.1.2 动物实验（二）
• 3.1.2.1 实验动物的一般情况
• 3.1.2.2 CDC对2型糖尿病大鼠血糖、体重、肾脏肥大指数及尿蛋白的影响
• 3.1.2.3 CDC对2型糖尿病大鼠肾小球体积的影响
• 3.1.2.4 CDC对2型糖尿病大鼠肾小球内12（S）-HETE水平的影响
• 3.1.2.5 CDC对2型糖尿病大鼠肾小球内P21、P16表达的影响
• 3.1.2.6 CDC对2型糖尿病大鼠肾小球内P38MAPK活性的影响
• 3.1.2.7 CDC对2型糖尿病大鼠肾小球内CollagenⅣ表达的影响
• 3.1.2.8 CDC对2型糖尿病大鼠组织学改变的影响
• 3.2 体外实验
• 3.2.1 12（S）-HETE对肾小球系膜细胞P21、P16表达的影响
• 3.2.2 CDC对高糖刺激后系膜细胞释放12（S）-HETE水平的影响
• 3.2.3 CDC对高糖刺激后系膜细胞P21、P16表达的影响
• 3.2.4 CDC对模拟ECM微环境体系中系膜细胞释放12（S）-HETE水平的影响
• 3.2.5 CDC对模拟ECM微环境体系中系膜细胞P21、P16表达的影响及其信号传导
• 第4章 讨论
• 第5章 结论
• 参考文献
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果
• 致谢