人乳腺癌细胞cDNA噬菌体表达文库的构建及单抗性质的研究

论文摘要

20世纪90年代以来,多种人类肿瘤抗原基因克隆的成功,大大推动了肿瘤免疫学理论的发展,也促进了肿瘤免疫诊断和免疫治疗的应用。由于肿瘤抗原在肿瘤诊断与治疗中具有重要的靶向作用,因此寻找特异性强、基因功能明确的靶分子成为肿瘤分子生物学的研究热点。近年来,随着分子生物学技术的提高和从细胞受体以及增殖调控的分子水平对肿瘤发病机制的进一步认识,开始了针对细胞受体、关键基因和调控分子为靶点的治疗,人们称之为“靶向治疗”。这些领域包括具有靶向性的表皮生长因子受体（EGFR）阻断剂,针对某些特定细胞标志物的单克隆抗体,针对某些癌基因和癌的细胞遗传学标志的药物,抗肿瘤血管生成的药物,抗肿瘤疫苗,基因治疗等等,并在不到10年的时间里有了长的进步。乳腺癌的发生与遗传等因素密切相关,随着分子生物学研究的深入,人们认识到肿瘤是一种基因性疾病。近年来,乳腺癌的发病率日趋增高,在乳腺癌特异抗原标志的众多研究中,除c-erbB-2、EGFR的特异性较高以外,一直未有新的特异性和灵敏度较高的乳腺癌抗原的报道。本课题研究针对我院实验科制备的多株人乳腺癌单克隆抗体进行免疫学性质的研究,并构建了人乳腺癌细胞cDNA噬菌体表达文库,这将为进一步利用单抗对cDNA文库进行免疫学筛选提供了前期准备。实验结果如下:1.人乳腺癌单抗效价的测定及IgG亚类的鉴定利用ELISA方法测定抗体的效价,用琼脂双向扩散鉴定其IgG亚类。测定的六种单克隆抗体(A6、C8、H11、E6、H6、C4)的效价分别为1:4000,1:8000,1:8000,1:32000,1:1000,1:2000,其中E6的效价可以达到106。其IgG亚类分别为IgG3,IgG1,IgG3,IgG1,IgG1,IgG3。2.抗人乳腺癌单抗（E6、H6）在各种肿瘤组织中的免疫组化研究利用免疫组织化学链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶（SP）法检测3例正常人组织,48例肿瘤患者组织,其中包括乳腺、胃、结肠、肺腺癌各12例。正常组织呈阴性染色,肿瘤组织呈现细胞膜和细胞浆阳性着色,E6阳性表达率在乳腺癌中为100%（12/12）,在肿瘤组织中综合表达率为94%（45/48）,H6阳性表达率在乳腺癌中为92%（11/12）,在肿瘤组织中综合表达率为83%（40/48）。3.人乳腺癌单克隆抗体对应抗原蛋白免疫印迹分析从乳腺癌组织中提出抗原蛋白质,运用抗原对应抗体进行免疫印迹实验,并以正常小鼠血清为蛋白标准。结果中作为蛋白标准的小鼠正常血清仅出现两条条带,其中一条为重链,分子量为54kD,另外一条为轻链,分子量为27kD。蛋白样品仅出现一条条带,无非特异性条带,通过计算其分子量为46.414kD。4.人乳腺癌细胞cDNA噬菌体文库的构建及鉴定用SMART技术,构建了人乳腺癌细胞cDNA噬菌体文库,从人乳腺癌细胞中分离总RNA并纯化mRNA,利用经修饰的oligo（dT）引物合成cDNA第一链,利用SMART核苷酸作为cDNA第一链在mRNA5’端延伸出去的模板,采用LD-PCR合成双链cDNA,双链cDNA经酶切和过柱分级分离后,克隆入λTriplEx2载体后经体外包装而成cDNA文库。原始人乳腺癌细胞cDNA噬菌体表达文库获得1.57×107个重组子,重组率达到98%。文库扩增后,滴度达到4.0×109pfu/ml,插入cDNA平均长度为2.5kb。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器与设备
• 2.1.4 常用培养基、缓冲液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 抗人乳腺癌单抗效价以及IgG亚类的鉴定
• 2.2.2 抗人乳腺癌单抗免疫组化研究
• 2.2.3 人乳腺癌单克隆抗体对应抗原蛋白免疫印迹分析
• 2.2.4 乳腺癌细胞cDNA噬菌体文库的构建
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 结果
• 3.1.1 抗人乳腺癌单抗效价以及IgG亚类的鉴定
• 3.1.2 抗人乳腺癌单抗免疫组化研究
• 3.1.3 人乳腺癌单克隆抗体对应抗原蛋白免疫印迹分析
• 3.1.4 乳腺癌细胞cDNA噬菌体文库的构建
• 3.2 讨论
• 3.2.1 抗人乳腺癌单抗效价以及IgG亚类的鉴定
• 3.2.2 抗人乳腺癌单抗免疫组化研究
• 3.2.3 人乳腺癌单克隆抗体对应抗原蛋白免疫印迹分析
• 3.2.4 乳腺癌细胞cDNA噬菌体文库的构建
• 3.3
• 3.3.1 RNA、mRNA的提取
• 3.3.2 引物的选择及SMART技术的优越性
• 第四章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间成果
• 致谢
• 统计学审稿证明