携带口蹄疫病毒B细胞表位的兔出血症病毒样颗粒的表达及其免疫原性研究

论文摘要

兔出血症（Rabbit Hemorrhagic Disease, RHD）是由兔出血症病毒（RHDV）引起的兔的传染性疾病,病程短、死亡率高,是家兔烈性传染病。VP60蛋白是RHDV主要的结构蛋白,在动物体内可诱导产生中和抗体,与免疫反应直接相关,是病毒免疫保护性抗原。研究发现在没有其他任何成分存在的条件下,VP60衣壳蛋白在体外可自然聚合成不包裹核酸的、与天然RHDV病毒粒子在物理形态上类似的病毒样颗粒（virus-like particles, VLPs）。这种病毒样颗粒具有很好的免疫原性,本身就可作为免疫佐剂,可以以胞吞或胞饮途径进入抗原提呈细胞,分别诱导体液免疫应答和细胞免疫应答。研究表明,这种病毒样颗粒也可嵌合表达外源基因,并作为疫苗载体。口蹄疫（foot-and-mouth disease virus, FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。研究表明O型FMDV至少有5个B细胞表位,其中最重要的一个表位由VP1的141-160位（G-H环）和C端200-213位氨基酸残基线性表位组成,为最重要的B细胞表位,是FMDV最重要的抗原位点。且VP1的第141-160位氨基酸残基中也含有至少一种T细胞表位,能诱导FMDV专一性的T细胞应答。本研究在RHDV衣壳蛋白的C-端（在外）、N-端（在内）和306-307位分别插入单个外源B细胞表位（FMDV VP1B细胞表位200-213aa）和双串联B细胞表位（FMDV VP1141～160aa-GS-（200～213aa））,构建6种重组转移载体并在Sf9细胞中进行表达,通过电镜观察和动物实验,研究加入这些外源片段对VLPs的组装及其免疫原性的影响。主要试验和结果如下：1、本试验根据GenBank数据库RHDV皖阜株衣壳蛋白VP60的基因序列设计针对VP60基因的特异性引物,PCR扩增出相应的核苷酸片段,将PCR扩增产物克隆入载体pMD19-T,经酶切鉴定正确后,连接至真核表达载体,经酶切鉴定正确后与经退火磷酸化的FMDVB细胞表位连接,进行PCR鉴定、DNA测序。获得的重组质粒转化DH10Bac,蓝白斑筛选后进行PCR鉴定即获得重组转移载体。试验结果显示：本试验成功构建6种重组穿梭载体,分别命名为CF.306F、NF、CFB、306FB和NFB。2、用重组穿梭载体转染Sf9细胞。转染后观察细胞病变,当出现明显的细胞病变时,收获病毒。提取细胞内重组杆状病毒RNA进行RT-PCR鉴定,阳性的作为重组杆状病毒原液进行扩增和表达,并通过间接免疫荧光（IFA）、血凝试验、蛋白质电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western-blot）等试验进行鉴定。试验结果显示：RT-PCR结果显示获得6种重组杆状病毒；IFA结果显示6种重组杆状病毒在Sf9细胞内表达；SDS-PAGE电泳分析6种嵌合蛋白均在Sf9细胞内表达,且大小约为65kDa; Western-blot显示6种嵌合蛋白（CF,306F、NF、CFB、306FB和NFB）均能被RHDV单抗A3C和牛O型FMDV多抗血清特异性识别,证明6种嵌合蛋白的载体和表位均具有良好的反应原性；本试验中表达的6种嵌合蛋白,仅NF和NFB有血凝性。3、6种嵌合蛋白经初步纯化后电镜观察。取表达的六种嵌合蛋白分别与弗氏佐剂1：1混合乳化,免疫ICR小鼠,并以RHDV灭活亚单位疫苗和O型FMDV合成肽疫苗作阳性对照,无菌PBS做阴性对照。免疫过程中对免疫小鼠进行尾静脉断尾采血,用间接ELISA测定0d、7d、14d、21d、28d、35d和42d血清内抗载体VP60和抗表位FMDV VP1ELISA抗体水平。结果显示：6种嵌合蛋白均能形成病毒样粒子（VLPs）,大小和形态与天然RHDV相似。6种嵌合蛋白通过皮下免疫的途径可诱导产生强烈抗载体VP60和中等强度抗FMDV VP1B细胞表位的体液免疫应答,其中嵌合蛋白NF针对载体和表位特异性抗体水平均最高；当插入外源片段长达126bp其表位抗体水平也保持较高水平,说明RHDV VLPs至少可以容纳126bp长度的基因；本研究中有无佐剂并不影响抗体水平；同时两种蛋白剂量大小（50ug/只和25ug/只）不影响表位抗体水平。本研究在分析了RHDV VLPs作为展示载体展示B细胞表位的可能性的基础上,在RHDV结构蛋白VP60的C-端、N-端和306～307aa处分别插入两种O型FMDV VP1蛋白的B细胞表位,成功构建6种重组穿梭载体,并在Sf9细胞中得到表达；免疫印迹显示其均具有良好的反应原性；电镜观察6种嵌合蛋白均可形成VLPs;动物实验显示RHDV-VLPs在小鼠体内能诱导强烈抗VP60和中等强度抗表位的体液免疫应答；RHDV-VLPs可以容纳长达126bp的外源片段也不影响其免疫原性。本研究为以RHDV VLPs为载体的多价疫苗研究提供理论基础,为后期评价RHDV VLPs展示系统奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 文献综述 兔病毒性出血症病毒（RHDV）研究进展
• 1 RHDV的分类
• 2 RHDV的生物学特性
• 2.1 RHDV的形态特征
• 2.2 RHDV的理化特性
• 2.3 RHDV的血凝特性
• 2.4 RHDV血清型及进化特点
• 2.5 RHDV的抗原性
• 2.6 RHDV的致病性
• 2.7 RHDV的培养
• 2.8 RHDV的诊断
• 3 RHDV的分子生物学研究进展
• 3.1 RHDV的结构
• 3.2 RHDV的结构蛋白
• 3.3 RHDV的非结构蛋白
• 3.4 亚基因组
• 4 病毒样颗粒（VLPs）的研究进展
• 4.1 VLPs的形成
• 4.2 VLPs的来源
• 4.3 VLPs的免疫原性
• 5 RHDV VP60研究新进展
• 6 FMDV表位研究动态
• 参考文献
• 第一章 6种携带口蹄疫病毒B细胞表位的重组转移载体的构建
• 摘要
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• ABSTRACT
• 第二章 6种嵌合蛋白的表达及鉴定
• 摘要
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• ABSTRACT
• 第三章 6种嵌合蛋白的空间构象和免疫原性研究
• 摘要
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• ABSTRACT
• 全文总结
• 附录
• 致谢