论文摘要
目的研究肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）中是否存在血管生成拟态（Vasculogenic Mimicry,VM）,探讨Twist诱导上皮间充质转变（Epithelial-mesenchymal Transition,EMT）在HCC血管生成中的作用,揭示HCC血管生成的可能分子机制。方法应用CD31和PAS双重染色及Hepatocyte免疫组化染色方法检测102例福尔马林固定、石蜡包埋肝细胞癌组织中是否存在血管生成拟态;免疫组织化学方法检测Twist、E-cadherin、β-catenin、Vimentin、MMP-9和MMP-2在有VM组与无VM组HCC中的表达,通过CD31免疫组化染色计数微血管密度（MVD）。结果一、HCC中存在血管生成拟态1 HE染色结果观察到19例肝癌组织中存在由肝癌细胞围成的管腔样结构,该管腔无内皮细胞衬附,管腔内可见红细胞,而管腔周围未见坏死的肝癌细胞,也未见到出血及炎细胞浸润;还观察到这种管腔样结构主要存在于分化差、恶性度高的实体型及低分化型的HCC中,提示这种结构与HCC恶性生物学行为相关。2 CD31/PAS双重染色及Hepatocyte免疫组化染色结果CD31为内皮细胞特异标记物,而Hepatocyte为肝癌细胞特异标记物,因此为了证实HE切片中观察到的管腔样结构为血管生成拟态,本文进行了CD31与PAS双重染色及Hepatocyte免疫组化染色。显微镜下观察显示:围成管腔样结构的细胞Hepatocyte染色阳性、CD31染色阴性,证实为肝癌细胞而不是内皮细胞,管腔内存在红细胞,一层PAS阳性物质围成环状结构将肿瘤细胞和红细胞分开,管腔内无坏死的肿瘤细胞及炎细胞,提示该管腔样结构不是由于肝癌细胞坏死形成的裂隙,而是由肝癌细胞通过自身塑型围成的类似血管的管道,而PAS阳性物质围成的环状结构就类似血管的基底膜,也即表明这种管道为VM。二、Twist及其相关蛋白免疫组化结果1 Twist蛋白在HCC中的表达Twist弥漫表达于肝癌细胞的胞浆内,约有30%的病例阳性细胞聚集呈局部高表达,有的癌巢中呈局灶性强阳性表达;约有10%,尤其是低分化病例的肝癌细胞核内也存在Twist的表达,提示Twist的定位与表达与肝癌细胞的分化程度密切相关。存在VM的HCC组Twist阳性表达率高,为78.95%（15/19）,阳性强度亦高,其阳性强度积分平均为2.94;而不存在VM的HCC组中Twist的阳性表达率为42.17%（35/83）,其阳性强度积分平均为2.62;两组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）,提示Twist作为一种转录因子在VM形成的信号转导过程中可能起重要作用。2上皮细胞粘附分子E-cadherin、β-catenin在HCC中的表达E-cadherin主要表达于癌旁肝硬化组织的细胞膜上,呈现黄褐色颗粒状着色,均匀分布。肝癌组织中E-cadherin表达降低甚至缺失。存在VM的HCC组E-cadherin的表达明显降低,其阳性表达率为15.79%（3/19）,而不存在VM的HCC组E-cadherin的表达阳性率为48.19%（40/83）,两者相比差异具有统计学意义（P＜0.05）,推测肝癌细胞之间粘附力的减弱可能是VM形成的一个重要因素。β-catenin阳性物质呈棕黄色颗粒,分布于肝癌细胞的细胞膜、细胞浆和细胞核,本文将β-catenin在细胞膜上的表达视为阳性表达,而在细胞浆或细胞核内的表达视为异常表达。HCC组织中β-catenin在绝大多数肝癌细胞上阴性表达,102例标本仅有16例阳性表达,而在异常表达的病例中β-catenin主要表达于细胞浆,32例β-catenin异常表达的肝癌组织,有8例出现核表达。存在VM的HCC（阳性表达率5.26%）与不存在VM的HCC组β-catenin的阳性表达率（18.07%）差异没有统计学意义。存在VM的HCC组β-catenin的异常表达率为52.63%（10/19）,而不存在VM的HCC组β-catenin的异常表达率为26.51%（22/83）,两组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）,可以看出作为一种与上皮细胞间粘附相关的重要粘附分子β-catenin在肝癌细胞上的表达复杂性,在肿瘤生长的不同阶段,不同的肿瘤细胞其表达的部位不尽相同,提示β-catenin的表达部位与其生物学行为密切相关,β-catenin的异常表达与VM的形成有着密切联系。3间叶标记蛋白Vimentin及基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9在HCC中的表达Vimentin阳性物质分布于肝癌组织的间质,主要位于肿瘤血管内皮细胞,而肝癌细胞均为阴性表达。Vimentin常特异性地表达于间叶细胞,但是上皮源性肿瘤在演进过程中,也可“反常”表达,这种现象与肿瘤细胞的恶性生物学行为密切相关,提示肝癌细胞的恶性生物学行为可能与Vimentin的表达无关。MMP-2与MMP-9弥漫表达于肝癌细胞胞浆内,在HCC间质中成纤维细胞及白细胞也存在两者的表达。癌旁肝硬化组织的肝细胞胞浆内也可见两者弱表达。MMP-2在存在VM的HCC组的阳性表达率为78.95%（15/19）,而不存在VM的HCC组的阳性表达率为69.88%（58/83）;MMP-2阳性表达率在两组之间比较差异没有统计学意义（P＞0.05）。MMP-9在存在VM的HCC组的阳性表达率为84.21%（16/19）,在不存在VM的HCC组阳性表达率为60.24%（50/83）。MMP-9阳性表达率在两组之间比较差异具有统计学意义（P＜0.05）,提示MMP-9高表达,降解并重塑细胞外基质为VM的形成提供了条件。4相关分析结果:Twist表达与E-cadherin表达呈负相关（r=-0.227,P＜0.05）,而与MMP-9表达呈正相关（r=0.347,P＜0.05）。三、Twist及其相关蛋白的表达与MVD的关系Twist高表达病例组MVD（20.48±13.52）大于低表达组（15.10±11.75）,差异具有统计学意义（P＜0.05）;MMP-2高表达病例组MVD（18.42±12.01）大于低表达组（12.52±10.01）,差异具有统计学意义（P＜0.05）;MMP-9高表达病例组MVD（20.08±13.36）大于低表达组（12.11±10.09）,差异具有统计学意义（P＜0.05）;E-cadherin、β-catenin高表达组与低表达组之间MVD的差异没有统计学意义（P＜0.05）,提示Twist、MMP-2和MMP-9可能促进HCC内皮依赖性血管的形成。四、Twist及其相关蛋白的表达与HCC临床病理参数的关系Twist、E-cadherin、β-catenin、MMP-2和MMP-9表达与HCC病人的年龄、性别、组织学类型、肿瘤大小以及Edmondson分级均不相关。Twist、E-cadherin、MMP-2和MMP-9的表达与HCC的临床分期及转移有关。Twist在临床分期为ⅢⅣ期的肝癌组织中阳性率为60.71%（34/56）,与ⅠⅡ期（阳性率为34.78%）相比,差异具有统计学意义（P＜0.05）;在转移组的阳性率为75%（27/36）,而无转移组的阳性率为34.85%（23/66）,两组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。E-cadherin在临床分期为ⅢⅣ期的阳性率为32.14%（18/56）,而在ⅠⅡ期的阳性率54.35%（25/46）,两组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。E-cadherin在转移组与无转移组的阳性率分别为27.78%（10/36）、50%（33/66）,两组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。MMP-2和MMP-9在转移组的阳性率分别为75%（27/36）、69.44%（25/36）,与无转移组（阳性率分别为42.12%、43.89%）相比都具有统计学意义（P＜0.05）,表明Twist的高表达、E-cadherin低表达可能加速了肝癌细胞的浸润进展,MMP-2和MMP-9的高表达导致细胞外基质和基底膜的降解加速,从而使肝癌细胞易于移出癌巢和进出血管,形成新的转移灶。结论1)HCC中存在VM,VM是肿瘤细胞为适应环境而产生的一种独特的血液供应模式,与内皮依赖性血管并存于肿瘤组织内,其发生率为18.6%（19/102）,存在VM的HCC恶性度高,易转移,预后差。2)存在VM的HCC组中Twist和MMP-9阳性表达率均高于不存在VM的HCC组,而存在VM的HCC组中E-cadherin阳性表达率低于不存在VM的HCC组;相关分析表明Twist阳性表达与E-cadherin呈负相关关系,而与MMP-9呈正相关关系,提示Twist可能通过抑制E-cadherin的表达,上调MMP-9的表达促进HCC中VM的形成。MMP-9表达上调降解并重塑细胞外基质,为肝癌细胞形成VM创造了条件。3)MVD在Twist、MMP-9及MMP-2高表达组均大于低表达组:相关分析表明Twist阳性表达与MMP-9呈正相关关系、而与MMP-2无相关关系,提示Twist可能主要通过上调MMP-9的表达促进HCC血管生成,MMP-9通过降解细胞外基质和基底膜,促进HCC血管生成。4)Twist蛋白可能参与了HCC局部微循环的建立,其机制可能为Twist蛋白过表达诱导上皮间充质转变,使肝癌细胞E-cadherin表达下调,β-catenin异常表达,β-catenin进入细胞核启动MMP-9基因的转录。5)Twist蛋白可能通过诱导EMT,上调MMP-9的表达促进了HCC的局部微循环的建立,加速了肝癌细胞的恶性进展及转移。
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