番茄溃疡病菌多克隆抗体和单克隆抗体的制备与鉴定

论文摘要

目的：番茄溃疡病(Bacterial canker of tomato)是一种严重危害番茄生产的细菌性病害,普遍发生在世界各大番茄主要产区。番茄溃疡病的致病菌是密执安棒杆菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis, Cmm)。Cmm主要是通过浸染番茄植株维管束系统从而导致植株干枯致死,由于Cmm具有致病性强、潜伏期长、易于传播等特点,对番茄溃疡病的产量和质量造成了严重损失带来了巨大的经济损失。Cmm病菌的检测对于番茄溃疡病的防治是至关重要的,番茄溃疡病菌的检测方法主要有生物学、血清学、分子生物学等方法,由于血清学检测如酶联免疫方法特异性好、灵敏度高且操作简单而被广泛应用。但是目前国内的番茄溃疡病菌抗体全部依赖国外进口,检测成本较高,使得免疫学方法无法在国内普及运用。为此,我们制备了效价高、特异性好的多克隆抗体和单克隆抗体,其目的是逐渐解决番茄溃疡病菌抗体和酶联免疫试剂盒的国产化问题,打破国外公司在该领域的技术和产品垄断,降低国内该病菌检测成本,促进该类试剂盒在我国的普及运用。方法：用番茄溃疡病菌全菌皮下免疫新西兰兔, ELISA测抗体效价,颈动脉采血,收集血清,对抗体特异性鉴定,最后对制备的多克隆抗体进行纯化。用番茄溃疡病菌全菌皮下免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,采用B细胞杂交瘤技术,经免疫、融合、间接ELISA筛选和克隆等,获得稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株,最后对得到的番茄溃疡病菌的单抗进行效价、特异性、亲和力等鉴定。结果：制备了针对番茄溃疡菌的多克隆抗血清,抗体效价为1：256000,Western Blot分析表明该抗体能特异性识别番茄溃疡病菌；经免疫BALB/c小鼠后获得3株番茄溃疡病菌单抗分别为1A4、1C3和1B7,经亚类鉴定分别是IgM、IgG1、IgG1;纯化腹水间接ELISA效价分别为1：25600、1：12800、1：12800；与其同属不同亚种无明显交叉反应。结论：制备的番茄溃疡病菌多克隆抗体和3株单克隆抗体均具有较高特异性和敏感性,可作为番茄溃疡病菌的检测抗体,其中,1A4的特异性最好。番茄溃疡病菌多克隆抗体和单克隆抗体的获得为进一步研发番茄溃疡病检测试剂盒奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词索引表
• 第一部分 番茄溃疡病菌的生物学特性及检测技术和单克隆抗体研究进展
• 第一节 番茄溃疡病菌的生物特性、危害程度及流行情况
• 1.1 番茄溃疡病菌的生物特性及症状危害
• 1.2 番茄溃疡病菌传播和流行
• 第二节 番茄溃疡病菌检测技术现状和研究进展
• 2.1 血清学方法检测
• 2.1.1 酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）
• 2.1.2 免疫荧光法（Immunofluorescence,IF）
• 2.2 分离培养法
• 2.3 分子生物学方法
• 2.3.1 DNA探针（DNA-probe）杂交
• 2.3.2 PCR方法
• 第三节 杂交瘤细胞和单克隆抗体的制备原理、研究进展及其应用
• 3.1 单克隆抗体产生历史和原理
• 3.1.1 单克隆抗体的概念
• 3.1.2 淋巴细胞杂交瘤的发展简史
• 3.1.3 杂交瘤单克隆抗体技术的理论基础
• 3.2 单克隆抗体制备流程图
• 3.3 单克隆抗体的研究进展
• 3.3.1 嵌合抗体
• 3.3.2 噬菌体抗体库技术
• 3.3.3 核糖体展示技术
• 3.3.4 转基因小鼠制备全人抗体
• 3.4 单克隆抗体的应用
• 3.4.1 单抗的预防应用
• 3.4.2 单抗的治疗应用
• 3.4.3 单抗的诊断及检测应用
• 立题依据和研究意义
• 第二部分 番茄溃疡病菌多克隆抗体、单克隆抗体的制备与鉴定
• （一） 材料
• （二） 方法
• 1. 番茄溃疡病菌多克隆抗体的制备
• 1.1 抗原制备
• 1.1.1 菌种活化和培养
• 1.1.2 PCR鉴定
• 1.2 新西兰兔免疫方法
• 1.3 间接ELISA方法测定多抗血清效价
• 1.4 免疫兔血清采集
• 1.5 血清的纯化
• 1.6 pAb的Western blot鉴定
• 2 番茄溃疡病菌单克隆抗体的制备及鉴定
• 2.1 抗原制备（同多抗）
• 2.2 动物免疫
• 2.3 小鼠血清效价的检测
• 2.4 骨髓瘤SP2/0细胞的复苏、扩大培养和收集
• 2.5 饲养层细胞的制备
• 2.6 细胞融合
• 2.6.1 免疫脾细胞悬液的制备
• 2.6.2 细胞融合方法
• 2.7 杂交瘤细胞的筛选
• 2.8 杂交瘤细胞的克隆化（有限稀释法）[57]
• 2.9 杂交瘤细胞株的扩大培养及冻存和复苏
• 2.10 单克隆抗体腹水的制备
• 2.11 单克隆抗体的纯化
• 2.12 紫外分光光度计测定蛋白含量[60]
• 2.13 单克隆抗体的鉴定
• 2.13.1 单抗效价的测定[61]
• 2.13.2 单克隆抗体亚类鉴定
• 2.13.3 单克隆抗体相对亲和力测定[62]
• 2.13.4 单克隆抗体的特异性测定
• 2.13.5 单克隆抗体杂交瘤细胞染色体分型[63]
• 2.13.6 McAb的Western-blot的鉴定[64]
• 第三部分 结果与分析
• 3.1 PCR鉴定结果
• 3.2 多克隆抗体制备结果
• 3.2.1 兔抗体血清效价测定结果
• 3.2.2 多克隆抗体IgG SDS-PAGE结果
• 3.3 单克隆抗体制备结果
• 3.3.1 最佳抗原、抗体浓度的确定
• 3.3.2 免疫与融合小鼠的选择
• 3.3.3 杂交瘤细胞株的亚克隆、筛选
• 3.3.4 单克隆抗体效价
• 3.3.5 单克隆抗体亚类鉴定及蛋白浓度测定
• 3.3.6 杂交瘤细胞染色体分析
• 3.3.7 腹水制备与腹水蛋白纯化结果分析
• 3.3.8 单克隆抗体亲和力测定
• 3.3.9 单克隆体特异性鉴定
• 第四部分 讨论
• 4.1 抗原和动物免疫
• 4.2 细胞融合
• 4.3 杂交瘤细胞的培养观察和单抗的筛选检测
• 4.4 单抗腹水的制备
• 4.5 单抗结果分析
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 致谢