论文摘要
目的：研究急性单核细胞白血病细胞系U-937分化前后MS4A7基因表达水平的变化情况。揭示其与白血病不同阶段的相关性。研究调控MS4A7基因表达的主要信号通路,揭示异常细胞信号转导引起白血病和MS4A7基因表达异常的相关性。构建含有MS4A7基因启动子的虫荧光素酶报告基因质粒,建立启动子区缺失片段的报告基因质粒,研究MS4A7基因启动子区的启动活性片段,以及调控MS4A7启动子区转录活性的转录因子。方法：1.50nmol/L佛波酯（PMA）刺激6孔板培养的U-937白血病细胞系,在诱导刺激的0、1、3、5d后收集总RNA,反转录为cDNA后实时荧光定量PCR检测细胞内MS4A7基因mRNA表达量的改变。2.ERK抑制剂U0126、p38 MAPK抑制剂SB230580、JNK抑制剂SP600125分别预处理U-937细胞6h,第一组处理后加入PMA,第二组不加PMA,两组细胞均作用48h后收集总RNA,反转录为cDNA后实时荧光定量PCR测定两种处理后对MS4A7基因的mRNA表达水平的影响。3.PCR扩增MS4A7基因启动子区片段（-1536bp-+164bp）,通过双酶切反应将MS4A7基因启动子片段和虫荧光素酶载体pGL3-Basic定向连接,得到pGL3-MS4A7-Promoter1～5重组质粒。重组子序列经双酶切、测序鉴定得到确认。将pGL3-MS4A7-Promoter系列重组质粒转染入细胞白血病细胞系（HL-60、U-937）和非白血病细胞系（HeLa、KOV-3）,通过检测细胞中虫荧光素酶的活性探究MS4A7启动子活性片段。4.建立基于实时荧光定量PCR分析的染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation, ChIP）方法初步探讨转录因子ATF2和ELKl对MS4A7基因启动子的调控作用。结果：1.U-937在50nmol/L PMA刺激24h后MS4A7基因mRNA表达量升高（P<0.05）,并随着刺激时间的延长和细胞的分化,表达进一步增强,3-5d表达量维持恒定（P<0.05）。2.与正常培养细胞的MS4A7基因mRNA水平相比,抑制剂U0126、SP600125直接处理的细胞MS4A7基因表达水平的差异无统计学意义（P>0.05）,抑制剂SB230580处理的细胞MS4A7基因表达降低（P<0.05）；与PMA分化后的MS4A7基因表达水平相比,U0126、SP600125预处理的细胞加入PMA以后,MS4A7基因表达量无统计学意义；SB230580预处理的细胞加入PMA以后,MS4A7基因表达量降低（P<0.05）。3.构建的含有MS4A7基因系列启动子缺失片段的虫荧光素酶报告基因pGL3-MS4A7-Promoter1～5经双酶切和测序验证后,证明插入的启动子序列正确；将重组的pGL3-MS4 A7-Promoter转染到白血病细胞系HL-60、U-937和非白血病细胞系HeL、SKOV-3后,通过虫荧光素酶活性检测发现MS4A7启动子活性在两种细胞内有明显差异。在白血病细胞系中,MS4A7基因启动子活性虫荧光素酶在-1536bp--704bp的区域活性最强。4.ATF2抗体和ELK1抗体沉淀过的DNA经实时定量PCR没有检测到MS4A7启动子的扩增信号。结论：1.PMA诱导的U-937细胞分化为巨噬细胞以后,MS4A7基因表达水平明显升高,提示MS4A7基因在细胞分化中有重要作用。2.MS4A7基因表达与p38 MAPK活化有密切联系,MS4A7基因的主要功能为参与细胞成熟过程中的信号传导,结合p38 MAPK在造血细胞分化中的功能我们认为,p38 MAPK参与PMA介导的U-937细胞分化的过程,而这是由幼稚细胞转向分化较为成熟的巨噬细胞的过程,这表明在P38 MAPK通路激活的同时,其下游的转录因子也被激活,而这些转录因子有可能是启动MS4A7基因表达的关键的转录因子。3.MS4A7基因启动子的活性在白血病细胞系与非白血病细胞系显示出明显差异。在白血病细胞系中,启动子的-703bp--79bp区域的启动子活性较弱,而-1536bp--704bp的区域启动子活性最强,揭示此区域对于基因的转录起到重要作用。4.尚不能认为MS4A7启动子区存在与转录因子ATF2和ELK1的结合位点,调控MS4A7基因表达的转录因子需要进一步研究。
论文目录
相关论文文献
- [1].含有MS4A7基因启动子的荧光素酶报告基因质粒的构建及意义[J]. 山东医药 2011(11)
标签：细胞分化论文; 信号传导论文; 启动子论文; 虫荧光素酶报告基因载体论文; 染色质免疫共沉淀论文;