论文摘要
5目的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）异常增殖在血管增生性疾病中扮演着十分重要的角色,是动脉粥样硬化形成、高血压、冠心病、经皮冠状动脉腔内成形术后再狭窄的病理基础。细胞生长因子、炎症因子、血流动力学异常等通过相关的细胞信号转导路径,特别是通过激活Ras原癌基因及其所介导的Ras-Raf-MAPK和Ras-PI3K-Akt信号转导路径,引起VSMC过度增殖。因此,阻扰这些路径,抑制细胞异常增殖,是防治血管增生性疾病的有效途径。线粒体融合蛋白2（mitofusin2, Mfn2）基因是近年来发现的一种新型的增殖抑制基因,它不仅抑制多种肿瘤细胞的增殖,并且参与线粒体的融合、调节线粒体的新陈代谢、维持线粒体的网状结构。在高血压大鼠和球囊损伤后再狭窄大鼠主动脉VSMC中Mfn2的表达均下降,因此上调Mfn2的表达可能会抑制该病理过程。本研究拟应用基因克隆和基因重组等方法,观察外源性Mfn2基因对A7r5细胞增殖的影响,并对其分子机制进行探讨,以期为mfn2成为血管增殖性疾病的治疗靶点提供实验依据。方法通过RT-PCR获得大鼠Mfn2 CDS序列的cDNA,扩增、纯化、回收Mfn2基因片段并与载体pGEM-T连接成重组克隆载体pGEM-T-mfn2,转化入E.coli DH5α感受态细胞大量扩增并行氨苄青霉素筛选。用HindⅢ和BamHⅠ双酶切扩增的大鼠Mfn2基因片段和质粒pEGFP-N1,再将回收的pEGFP-N1大片段与Mfn2基因片段重组,转化感受态DH5α。采用质粒小提产物PCR、HindⅢ和BamHⅠ双酶切和序列分析方法,确定目标片段的存在和序列正确性。将测序正确的重组质粒pEGFP-mfn2在阳离子脂质体的介导下体外转染A7r5细胞,将细胞分成三组:空白对照组A7r5（未转染组）,空载体对照组（pEGFP-N1组,转染空质粒）,实验组（A7r5-Mfn2-GFP组,转染pEGFP-mfn2）。24h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP）表达情况,分别于转染后48h收获三组细胞,经RT-PCR、Western blot方法检测Mfn2在A7r5细胞的表达情况。转染成功且效率稳定后,通过细胞计数法、MTS法检测Mfn2对A7r5增殖的影响。流式细胞术分析外源性Mfn2基因在体外对A7r5细胞周期分布的影响。Western blot检测三组细胞的磷酸化Raf、磷酸化ERK1/2和磷酸化AKT蛋白表达的变化,采用方差分析对数据进行统计学处理。结果从A7r5细胞总RNA中经RT-PCR扩增出一条约2.2kb的片段。重组质粒转化感受态DH5α后,通过抗性基因筛选出阳性克隆。质粒小提产物PCR显示存在2.2kb的特异性条带;酶切结果显示重组质粒被切成4.7kb大小的pEGFP-N1载体和2.2kb大小的目的片段;经测序,目的片段的序列与GeneBank中大鼠Mfn2基因的编码序列完全一致;进一步证实成功地构建了含大鼠Mfn2基因的重组真核表达载体。荧光显微镜下观察,转染成功的A7r5细胞中有GFP表达,发出特异性的荧光。按转染率=暗视野所见发绿色荧光的细胞数/明视野所见细胞总数×100%,计算转染率为70%。RT-PCR及Western blot证实转染pEGFP-mfn2组的A7r5细胞中Mfn2mRNA和蛋白表达较对照两组高。细胞计数法、MTS法检测转染pEGFP-mfn2组细胞数明显低于空白对照组和空载体对照组（P<0.05）,而对照两组细胞数无明显差异。转染后48h流式细胞仪检测结果表明实验组中多数VSMC停滞于GI期,细胞比例为61.733±3.755,与对照组相比差异有统计学意义（F=109.8,P<0.05）,两对照组相比差异无统计学意义。Western blot结果显示:实验组细胞与两对照组细胞相比,转染后48h磷酸化c-Raf（p-c-Raf）,磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）和磷酸化AKT（p-AKT）的表达水平明显降低,其差异有显著性（P<0.05）。结论1. Mfn2基因过表达可以明显抑制A7r5细胞的增殖。2. Mfn2基因抑制A7r5细胞增殖的机制可能是通过抑制Ras-Raf-ERK1/2和Ras-PI3K-AKT信号通路,下调磷酸化Raf-1蛋白,磷酸化ERK1/2蛋白和磷酸化AKT蛋白的表达来实现的。
论文目录
相关论文文献
- [1].利肺片对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的影响[J]. 中成药 2020(02)
- [2].慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立与评价[J]. 中国实验动物学报 2020(02)
- [3].国内外大鼠和小鼠微生物、寄生虫检测标准的比较[J]. 实验动物与比较医学 2020(02)
- [4].武夷岩茶对酒精性肝损伤大鼠的护肝作用[J]. 武夷学院学报 2020(03)
- [5].参芎葡萄糖注射液对大鼠肺动脉高压的治疗作用及其机制[J]. 中国生物制品学杂志 2020(06)
- [6].口服蛋氨酸饲料致大鼠心室重塑的研究[J]. 天津医科大学学报 2020(03)
- [7].腹部推拿对结肠慢传输型便秘大鼠的治疗效果[J]. 新疆医科大学学报 2020(04)
- [8].基于UHPLC-Q-Exactive MS分析鉴定隐丹参酮在大鼠体内的代谢产物[J]. 质谱学报 2020(04)
- [9].针刺对慢性温和刺激大鼠粪便代谢的影响[J]. 针灸临床杂志 2020(07)
- [10].两种不同方法制造简易大鼠挤压伤模型的研究[J]. 宁夏医科大学学报 2020(08)
- [11].酸枣仁水提物对焦虑大鼠症状的改善及其对肠道菌群的影响[J]. 现代食品科技 2019(11)
- [12].早期肠内营养对重症肺炎大鼠免疫功能的影响分析[J]. 中国医学前沿杂志(电子版) 2017(01)
- [13].右美托咪定后处理对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 临床医学工程 2017(02)
- [14].滨蒿内酯对大鼠实验性变应性鼻炎的疗效及机制[J]. 贵州医科大学学报 2017(01)
- [15].黄连解毒汤对营养性肥胖大鼠的毒性研究[J]. 光明中医 2017(10)
- [16].三七总皂甙对骨折大鼠血管内皮生长因子基因扩增及蛋白表达水平影响的研究[J]. 临床医药文献电子杂志 2017(51)
- [17].小花棘豆中毒对大鼠下丘脑—垂体—卵巢轴α-甘露糖苷酶的影响[J]. 福建农林大学学报(自然科学版) 2016(01)
- [18].法舒地尔对百草枯致大鼠肺纤维化的干预作用[J]. 浙江实用医学 2016(01)
- [19].富血小板血浆对创伤性颅脑损伤大鼠神经功能的保护作用[J]. 吉林大学学报(医学版) 2016(05)
- [20].白虎汤对全身炎症反应综合征大鼠炎症因子的影响[J]. 四川中医 2015(01)
- [21].长期饮用淡化海水对大鼠血脂影响[J]. 中国公共卫生 2015(07)
- [22].辛伐他汀预处理对大鼠神经源性肺水肿的作用及其机制[J]. 中国动脉硬化杂志 2015(10)
- [23].猫捉大鼠[J]. 中小学音乐教育 2020(07)
- [24].西维来司钠对大鼠脑出血保护作用机制的实验研究[J]. 现代养生 2017(10)
- [25].药对藿香-陈皮配伍前后对功能性消化不良大鼠的初步药效学研究[J]. 健康之路 2017(07)
- [26].VND3207药物对中子辐照大鼠脏器指数的影响[J]. 中国原子能科学研究院年报 2016(00)
- [27].韭菜洋葱有助睡眠[J]. 益寿宝典 2017(14)
- [28].毒瘾也“世袭”?雄性大鼠毒瘾遗传给后代[J]. 创新时代 2017(08)
- [29].脉冲射频治疗对带状疱疹后神经痛模型大鼠脊髓背角自噬的影响[J]. 临床麻醉学杂志 2019(12)
- [30].麝香保心丸对高尿酸血症大鼠内皮功能的影响[J]. 中西医结合心脑血管病杂志 2019(23)
标签：线粒体融合蛋白基因论文; 细胞论文; 细胞增殖论文;