本文主要研究内容
作者梁瑶（2019）在《黄曲霉毒素核酸适配体的结构优化、表征及应用》一文中研究指出：适配体作为新型生物识别分子,其研究及应用越来越受到研究者的关注。随着适配体研究及应用领域的不断深入,适配体的优势日益凸显,但同时也存在一定的问题亟待解决。适配体与真菌毒素的分子结合作用机制尚不完全明晰,限制了适配体的纵深发展。同时,由单一靶标识别向多靶标同时识别的适配体检测技术亟待开发。因此,为了给适配体分子探针的设计、筛选、构效关系等提供理论性指导,本研究以黄曲霉毒素B1适配体为研究对象,采用序列剪裁优化、碱基突变替换等对适配体序列结构进行优化,结合等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry,ITC）、荧光分析法深入研究“适配体-靶标”识别过程的分子基础,揭示适配体与靶标分子结合作用的分子机制,并基于理论基础进行应用研究的拓展。本课题围绕黄曲霉毒素核酸适配体的结合机制研究及应用,主要研究工作如下:1.黄曲霉毒素B1适配体的剪裁优化。为了阐明AFB1适配体的结合部位,易于后续修饰与结合机制研究,因此基于已报道的AFB1的原始适配体,拟合其二级结构进行分析,对序列进行剪裁优化。通过软件Mfold对AFB1适配体的二级结构进行分析,综合考虑适配体的作用结构和稳定性等因素,在保留茎环结构的基础上,对其进行适当的剪裁优化。通过ITC实验、荧光分析实验分别对剪裁优化适配体的亲和力和特异性进行验证,以确认剪裁优化是否有效。Apt-2作为有效的剪裁优化适配体中,碱基数量最短的一条,其Kd值、结合位点数、热力学参数均与原始适配体相近甚至更优,且对其他真菌毒素无结合作用,因此本剪裁优化实验中效果最优的适配体为Apt-2。2.黄曲霉毒素B1与适配体结合机制研究。为了探究适配体与AFB1的结合机制,基于上述获得的剪裁优化适配体Apt-2,根据二级结构中的“茎环”部分,设计碱基突变的位点。通过ITC实验、荧光分析实验分别进行亲和力验证,发现任何“环”部位的突变均会导致适配体亲和力的丧失,因此推测Apt-2是以整个“环”状部位为结合单元,去识别并捕获环境中的靶标,实现结合过程。为了明晰已报道的AFB1适配体与AFB1结构类似物也具有亲和性的原因,对AFB1的分子结构组成物质和AFB1的结构类似物进行ITC实验、荧光分析实验,探究AFB1的结合部位。结果显示,AFB1的结构类似物AFB2、AFG1、AFM1通过ITC实验、荧光分析实验验证均具有与Apt-2的强结合能力。因此,AFB1及其3种结构类似物与Apt-2结合的结构域是4种毒素共有的中心结构部位。推测AFB1及其结构类似物分子在与Apt-2结合的过程中,暴露结构域,被Apt-2的“环”状部分识别从而进一步捕获实现结合。3.黄曲霉毒素适配体亲和柱的设计。基于上述研究发现,建立了一种基于适配体Apt-2对四种黄曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1、AFM1）的适配体亲和柱,用于样品前处理中的黄曲霉毒素的富集与净化。以链霉亲和素琼脂糖凝胶和生物素修饰的适配体按体积比1:2（适配体浓度为2μM）偶联获得偶联物为载体进行装填,组装成适配体亲和柱。适配体亲和柱在pH 7.4左右,温度25°C左右,有机物含量小于3%的条件下可发挥最大效能。在不超过8次使用次数时,适配体亲和柱的靶标结合率可维持在85%以上,同时适配体的亲和柱的单次最大柱容量为200 ng黄曲霉毒素。对于其他种属的真菌毒素,适配体亲和柱均不结合,呈现良好的特异性。此适配体亲和柱可用于实际样品中黄曲霉毒素的截留与富集,实现样品净化的目的。4.桥联适配体的设计。为了在适配体强特异性的优势基础上,开发多种靶标同时检测的桥联适配体,将获得的剪裁优化适配体Apt-2以小片段碱基序列作为桥联媒介,与赭曲霉毒素A（OTA）的适配体进行桥联,获得桥联适配体。通过桥联适配体的5’端和3’端荧光基团被淬灭导致荧光消失,与靶标结合后荧光恢复的过程表征桥联适配体有效。对四条桥联适配体进行ITC实验验证适配体的亲和力,基于解离常数、结合位点数、热力学参数等,最终确定以Poly A连接的QL-A作为桥联适配体的最优选择。通过等温滴定量热实验验证,发现QL-A不具有对其他真菌毒素的结合能力。桥联适配体QL-A,具有比单一适配体更低的Kd值,即亲和力得以提高,同时仍保持良好的特异性。
Abstract
kuo pei ti zuo wei xin xing sheng wu shi bie fen zi ,ji yan jiu ji ying yong yue lai yue shou dao yan jiu zhe de guan zhu 。sui zhao kuo pei ti yan jiu ji ying yong ling yu de bu duan shen ru ,kuo pei ti de you shi ri yi tu xian ,dan tong shi ye cun zai yi ding de wen ti ji dai jie jue 。kuo pei ti yu zhen jun du su de fen zi jie ge zuo yong ji zhi shang bu wan quan ming xi ,xian zhi le kuo pei ti de zong shen fa zhan 。tong shi ,you chan yi ba biao shi bie xiang duo ba biao tong shi shi bie de kuo pei ti jian ce ji shu ji dai kai fa 。yin ci ,wei le gei kuo pei ti fen zi tan zhen de she ji 、shai shua 、gou xiao guan ji deng di gong li lun xing zhi dao ,ben yan jiu yi huang qu mei du su B1kuo pei ti wei yan jiu dui xiang ,cai yong xu lie jian cai you hua 、jian ji tu bian ti huan deng dui kuo pei ti xu lie jie gou jin hang you hua ,jie ge deng wen di ding liang re fa （Isothermal Titration Calorimetry,ITC）、ying guang fen xi fa shen ru yan jiu “kuo pei ti -ba biao ”shi bie guo cheng de fen zi ji chu ,jie shi kuo pei ti yu ba biao fen zi jie ge zuo yong de fen zi ji zhi ,bing ji yu li lun ji chu jin hang ying yong yan jiu de ta zhan 。ben ke ti wei rao huang qu mei du su he suan kuo pei ti de jie ge ji zhi yan jiu ji ying yong ,zhu yao yan jiu gong zuo ru xia :1.huang qu mei du su B1kuo pei ti de jian cai you hua 。wei le chan ming AFB1kuo pei ti de jie ge bu wei ,yi yu hou xu xiu shi yu jie ge ji zhi yan jiu ,yin ci ji yu yi bao dao de AFB1de yuan shi kuo pei ti ,ni ge ji er ji jie gou jin hang fen xi ,dui xu lie jin hang jian cai you hua 。tong guo ruan jian Mfolddui AFB1kuo pei ti de er ji jie gou jin hang fen xi ,zeng ge kao lv kuo pei ti de zuo yong jie gou he wen ding xing deng yin su ,zai bao liu jing huan jie gou de ji chu shang ,dui ji jin hang kuo dang de jian cai you hua 。tong guo ITCshi yan 、ying guang fen xi shi yan fen bie dui jian cai you hua kuo pei ti de qin he li he te yi xing jin hang yan zheng ,yi que ren jian cai you hua shi fou you xiao 。Apt-2zuo wei you xiao de jian cai you hua kuo pei ti zhong ,jian ji shu liang zui duan de yi tiao ,ji Kdzhi 、jie ge wei dian shu 、re li xue can shu jun yu yuan shi kuo pei ti xiang jin shen zhi geng you ,ju dui ji ta zhen jun du su mo jie ge zuo yong ,yin ci ben jian cai you hua shi yan zhong xiao guo zui you de kuo pei ti wei Apt-2。2.huang qu mei du su B1yu kuo pei ti jie ge ji zhi yan jiu 。wei le tan jiu kuo pei ti yu AFB1de jie ge ji zhi ,ji yu shang shu huo de de jian cai you hua kuo pei ti Apt-2,gen ju er ji jie gou zhong de “jing huan ”bu fen ,she ji jian ji tu bian de wei dian 。tong guo ITCshi yan 、ying guang fen xi shi yan fen bie jin hang qin he li yan zheng ,fa xian ren he “huan ”bu wei de tu bian jun hui dao zhi kuo pei ti qin he li de sang shi ,yin ci tui ce Apt-2shi yi zheng ge “huan ”zhuang bu wei wei jie ge chan yuan ,qu shi bie bing bu huo huan jing zhong de ba biao ,shi xian jie ge guo cheng 。wei le ming xi yi bao dao de AFB1kuo pei ti yu AFB1jie gou lei shi wu ye ju you qin he xing de yuan yin ,dui AFB1de fen zi jie gou zu cheng wu zhi he AFB1de jie gou lei shi wu jin hang ITCshi yan 、ying guang fen xi shi yan ,tan jiu AFB1de jie ge bu wei 。jie guo xian shi ,AFB1de jie gou lei shi wu AFB2、AFG1、AFM1tong guo ITCshi yan 、ying guang fen xi shi yan yan zheng jun ju you yu Apt-2de jiang jie ge neng li 。yin ci ,AFB1ji ji 3chong jie gou lei shi wu yu Apt-2jie ge de jie gou yu shi 4chong du su gong you de zhong xin jie gou bu wei 。tui ce AFB1ji ji jie gou lei shi wu fen zi zai yu Apt-2jie ge de guo cheng zhong ,bao lou jie gou yu ,bei Apt-2de “huan ”zhuang bu fen shi bie cong er jin yi bu bu huo shi xian jie ge 。3.huang qu mei du su kuo pei ti qin he zhu de she ji 。ji yu shang shu yan jiu fa xian ,jian li le yi chong ji yu kuo pei ti Apt-2dui si chong huang qu mei du su （AFB1、AFB2、AFG1、AFM1）de kuo pei ti qin he zhu ,yong yu yang pin qian chu li zhong de huang qu mei du su de fu ji yu jing hua 。yi lian mei qin he su qiong zhi tang ning jiao he sheng wu su xiu shi de kuo pei ti an ti ji bi 1:2（kuo pei ti nong du wei 2μM）ou lian huo de ou lian wu wei zai ti jin hang zhuang tian ,zu zhuang cheng kuo pei ti qin he zhu 。kuo pei ti qin he zhu zai pH 7.4zuo you ,wen du 25°Czuo you ,you ji wu han liang xiao yu 3%de tiao jian xia ke fa hui zui da xiao neng 。zai bu chao guo 8ci shi yong ci shu shi ,kuo pei ti qin he zhu de ba biao jie ge lv ke wei chi zai 85%yi shang ,tong shi kuo pei ti de qin he zhu de chan ci zui da zhu rong liang wei 200 nghuang qu mei du su 。dui yu ji ta chong shu de zhen jun du su ,kuo pei ti qin he zhu jun bu jie ge ,cheng xian liang hao de te yi xing 。ci kuo pei ti qin he zhu ke yong yu shi ji yang pin zhong huang qu mei du su de jie liu yu fu ji ,shi xian yang pin jing hua de mu de 。4.qiao lian kuo pei ti de she ji 。wei le zai kuo pei ti jiang te yi xing de you shi ji chu shang ,kai fa duo chong ba biao tong shi jian ce de qiao lian kuo pei ti ,jiang huo de de jian cai you hua kuo pei ti Apt-2yi xiao pian duan jian ji xu lie zuo wei qiao lian mei jie ,yu zhe qu mei du su A（OTA）de kuo pei ti jin hang qiao lian ,huo de qiao lian kuo pei ti 。tong guo qiao lian kuo pei ti de 5’duan he 3’duan ying guang ji tuan bei cui mie dao zhi ying guang xiao shi ,yu ba biao jie ge hou ying guang hui fu de guo cheng biao zheng qiao lian kuo pei ti you xiao 。dui si tiao qiao lian kuo pei ti jin hang ITCshi yan yan zheng kuo pei ti de qin he li ,ji yu jie li chang shu 、jie ge wei dian shu 、re li xue can shu deng ,zui zhong que ding yi Poly Alian jie de QL-Azuo wei qiao lian kuo pei ti de zui you shua ze 。tong guo deng wen di ding liang re shi yan yan zheng ,fa xian QL-Abu ju you dui ji ta zhen jun du su de jie ge neng li 。qiao lian kuo pei ti QL-A,ju you bi chan yi kuo pei ti geng di de Kdzhi ,ji qin he li de yi di gao ,tong shi reng bao chi liang hao de te yi xing 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自江南大学的梁瑶，发表于刊物江南大学2019-10-21论文，是一篇关于适配体论文,黄曲霉毒素论文,结合机制论文,应用论文,江南大学2019-10-21论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自江南大学2019-10-21论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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