论文摘要
目的1、建立2型糖尿病早期肾病大鼠模型2、观察益气散聚固肾方对2型糖尿病早期肾病大鼠微量白蛋白尿、糖脂代谢及胰岛素抵抗的作用；3、研究益气散聚固肾方对2型糖尿病早期肾病大鼠肾脏组织病理改变及相关蛋白的作用；4、研究益气散聚固肾方对2型糖尿病早期肾病大鼠肾脏肾素-血管紧张素系统的影响；5、在证实益气散聚固肾方防治2型糖尿病大鼠早期肾病疗效确切的基础上,对其作用的可能机制改善胰岛素抵抗及拮抗肾脏肾素-血管紧张素系统进行研究,为临床进一步研究与应用该药提供较可靠的实验依据。方法1、2型糖尿病早期肾病大鼠模型的建立清洁级雄性SD大鼠65只,体重180-220g。随机分为2组：普通饲料组（进食普通饲料）10只和高脂组（进食高脂饲料）55只。2组大鼠自由进食、饮水4周。4周后,隔夜空腹12小时,高脂组55只大鼠单次腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin, STZ） 35mg/kg（体重）；普通饲料组10只大鼠腹腔注射相应容量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 4.4）。注射3天后,尾尖采血测随机血糖,大于等于16.67mmol/L者作为2型糖尿病造模成功大鼠。于注射STZ后第7天用毛细管眼眶后静脉丛采血（隔夜空腹12小时）测血糖、胰岛素、血脂,计算HOMA-IR;代谢笼收集24小时尿液,检测尿微量白蛋白、尿肌酐,计算尿微量白蛋白/尿肌酐,计算大鼠24h尿液微量白蛋白排泄率；行腹腔注射葡萄糖耐量试验、腹腔注射胰岛素耐量试验评价胰岛素抵抗状态。与普通饲料组比较以确认2型糖尿病大鼠早期肾病模型成功。持续观察9周至研究结束,以确定模型的稳定性。2、益气散聚固肾方对2型糖尿病早期肾病大鼠微量白蛋白尿、糖脂代谢及胰岛素抵抗作用的研究动物实验分组：造模成功大鼠随机分为6组：模型组、益气散聚固肾方低剂量组、益气散聚固肾方中剂量组、益气散聚固肾方高剂量组、氯沙坦治疗组、罗格列酮治疗组（每组10只）。普通饲料组作为对照组（10只）。益气散聚固肾方低、中、高剂量分别为0.47、1.41、2.82g（生药）/100g（体重）,氯沙坦剂量为20mg/kg（体重）,罗格列酮剂量为4 mg/kg（体重）。益气散聚固肾方、氯沙坦和罗格列酮每天灌胃1次,持续8周。实验过程中除对照组大鼠予普通饲料外,余实验大鼠均予高脂饲料。在药物干预后的第4周（腹注STZ后第5周）、第8周（腹注STZ后第9周）,收集24小时尿液、空腹采血,取肾脏和骨骼肌组织-80℃冻存。检验指标同前,并取对照组、模型组、益气散聚固肾方高剂量组、氯沙坦组、罗格列酮组大鼠骨骼肌组织,匀浆、抽提蛋白、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、western blot方法,检测各组骨骼肌组织GLUT-4胞浆、胞膜蛋白表达。3、益气散聚固肾方对2型糖尿病早期肾病大鼠肾脏组织病理改变及相关蛋白作用的研究取对照组、模型组、益气散聚固肾方高剂量组、氯沙坦组、罗格列酮组大鼠肾组织做石蜡切片行HE染色、PAS染色,进行组织病理形态学观察。Western blot方法检测各组肾脏组织nephrin、VEGFR2、p-VEGFR2（Tyr951）、p-VEGFR2（Tyr1175）、TNF-α和IL-6蛋白表达水平。4、益气散聚固肾方对2型糖尿病早期肾病大鼠肾脏肾素-血管紧张素系统影响的研究Western blot方法检测各组肾脏组织Ang II与ATl蛋白表达水平。结果1、2型糖尿病大鼠早期肾病模型的建立与普通饲料组大鼠比较,高脂饲料饲养4周后予STZ（35mg/kg）诱导的模型组大鼠在腹注STZ后第7天：空腹血糖（12.82±1.08 mmol/L vs.3.60±0.31 mmol/L, P<0.01）、TG （2.24±0.12 mmol/L vs.0.78±0.05 mmol/L, P<0.01）、TC （8.40±0.49 mmol/L vs.2.14±0.06 mmol/L, P<0.01）、LDL-c （7.84±0.51 mmol/L vs.0.72±0.04 mmol/L, P<0.01）明显升高,HDL-c （0.57±0.03 mmol/L vs. 1.27±0.03 mmol/L, P<0.01）明显降低；24h尿微量白蛋白排泄率（52.59±6.61ug/24h vs.5.01±0.56 ug/24h, P<0.01）、尿微量白蛋白／肌酐（17.57±3.37 ug/umol vs.8.94±1.19 ug/umol, P<0.01）明显增高,血清肌酐无明显差异；血清胰岛素水平、HOMA-IR评分明显增高；体重增加明显；腹腔注射葡萄糖耐量和胰岛素耐量试验证实模型组胰岛素抵抗明显。结果提示2型糖尿病早期肾病大鼠模型造模成功。在9周的研究期内,与普通饲料组比较,高脂饲养联合STZ诱导的模型组大鼠空腹血糖、甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平均明显升高；高密度脂蛋白胆固醇水平明显降低；胰岛素水平、体重明显下降；24h尿微量白蛋白排泄率、尿微量白蛋白／肌酐均明显升高；血肌酐无明显变化；胰岛素抵抗明显。结果提示高脂饲养联合STZ诱导的2型糖尿病早期肾病大鼠模型成功,稳定、可靠。2、益气散聚固肾方对2型糖尿病早期肾病大鼠微量白蛋白尿、糖脂代谢及胰岛素抵抗作用的研究益气散聚固肾方对2型糖尿病早期肾病的防治效果呈现量效与时效性,其疗程长、剂量大者效果佳。治疗8周后,与模型组比较,益气散聚固肾方高剂量组：（1）有效减轻微量白蛋白尿：24h尿微量白蛋白排泄率（29.64±6.32ug/24h vs.51.50±6.54 ug/24h, P<0.05）、尿微量白蛋白／肌酐（8.52±0.65 ug/umol vs. 17.21±3.32 ug/umol, P<0.01）明显下降,疗效与氯沙坦组相当；（2）有效改善糖脂代谢紊乱：下调空腹血糖水平（12.16±1.00 mmol/L vs.17.65±2.22 mmol/L, P<0.01）,TG下调56.3%（0.87±0.15 mmol/L vs.1.99±0.26 mmol/L, P<0.01）、TC下调49.1%（3.31±0.52 mmol/L vs.6.50±1.04 mmol/L, P<0.01）、LDL-c下调58.8%（2.47±0.50 mmol/L vs.6.00±1.07 mmol/L, P<0.01）、HDL-c上调68%（0.84±0.08 mmol/L vs.0.50±0.03 mmol/L, P<0.01）,益气散聚固肾方改善糖脂代谢紊乱的综合作用与氯沙坦和罗格列酮相比优势明显；（3）不引起体重增加；（4）有效改善胰岛素抵抗：减小HOMA-IR评分,IPGTT示改善葡萄糖耐量异常,ITT示增强胰岛素敏感性,促进GLUT-4由胞浆转位至胞膜,效果与罗格列酮组相当。3、益气散聚固肾方对2型糖尿病早期肾病大鼠肾脏组织病理改变及相关蛋白作用的研究治疗8周后,与模型组大鼠比较,益气散聚固肾方高剂量组大鼠肾小球基底膜增厚（9.80±1.02 um vs.13.83±2.37 um,P<0.05）、细胞外基质增生（0.23±0.03 vs.1.06±0.22,P<0.01）明显减轻。大鼠肾组织足细胞裂孔隔膜蛋白nephrin表达明显上调,肾组织VEGFR2蛋白表达及其酪氨酸磷酸化p-VEGFR2（Tyr951）、p-VEGFR2（Tyrl 175）水平均明显下调,肾组织TNF-α、IL-6蛋白表达明显下调。4、益气散聚固肾方对2型糖尿病早期肾病大鼠肾脏肾素-血管紧张素系统影响的研究治疗8周后,与模型组大鼠比较,益气散聚固肾方高剂量组大鼠肾组织AngII与ATl蛋白表达均明显下调。结论1、高脂饮食联合单次低剂量STZ腹腔注射可诱导出稳定可靠的2型糖尿病及其早期肾病大鼠模型。适合药物及机制的研究。2、益气散聚固肾方可明显减轻2型糖尿病早期肾病大鼠微量白蛋白尿,治疗效果与氯沙坦相当。可明显减轻2型糖尿病早期肾病大鼠肾小球基底膜增厚、细胞外基质增生；上调肾组织足细胞裂孔隔膜蛋白nephrin表达；下调肾组织血管内皮细胞生长因子受体VEGFR2的蛋白表达及磷酸化；下调肾组织TNF-α、IL-6蛋白表达。可拮抗2型糖尿病早期肾病大鼠肾脏肾素-血管紧张素系统,双重阻滞肾组织AngⅡ与AT1蛋白表达。提示该方可有效防治2型糖尿病早期肾病,其治疗效果呈现量效与时效性,高剂量治疗效果最佳。3、益气散聚固肾方可有效改善2型糖尿病早期肾病大鼠的糖脂代谢紊乱。促进模型大鼠骨骼肌组织GLUT-4由胞浆至胞膜的转位,有效改善2型糖尿病早期肾病大鼠胰岛素抵抗。作用与罗格列酮相当,但不引起体重增加。其综合调脂作用与氯沙坦和罗格列酮相比,存在一定优势。总之,益气散聚固肾方可改善2型糖尿病早期肾病大鼠微量白蛋白尿、糖脂代谢紊乱、肾组织病理学改变,调节糖尿病肾病相关蛋白表达。其作用机制可能与改善胰岛素抵抗及拮抗肾脏肾素-血管紧张素系统有关,其作用与罗格列酮及氯沙坦相当,体现了中医药多环节、多靶点综合作用的特色,为在时相上提前干预糖尿病肾病提供可靠的实验依据。
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