β-内酰胺酶CTX-M-14基因的基因环境及TEM-57型酶特性研究

论文摘要

本试验采用细菌分离及生化鉴定等方法对疑似鸡肺炎克雷伯菌进行培养鉴定,用微量稀释法测定了抗菌药物对临床分离的鸡源肺炎克雷伯菌的最小抑菌浓度（MIC）,并通过β-内酰胺酶基因型检测、基因亚型的分析,确定鸡源肺炎克雷伯菌产β-内酰胺酶的分子类型。为进一步了解产CTX-M-14型ESBL基因的传播机制和基因环境结构,对产CTX-M-14型ESBL基因进行了质粒接合传递试验;对阳性接合子进行质粒抽提并酶切,PBR322载体连接并转化,插入片段确认成功后,送生物公司进行测序,并进行Blast序列比对。最后,对本实验室鉴定保存的含TEM-57型β-内酰胺酶基因的克隆表达菌进行水解试验和抑酶保护试验,检测该型酶对抗生素的水解率和抑制剂与β-内酰胺类药物合用后对该酶的抑酶保护率,旨在为兽医临床合理使用抗生素提供理论依据。鸡源肺炎克雷伯菌耐药表型、基因型检测结果表明,仅有碳青霉烯类（亚胺培南）、头孢吡肟和粘菌素对肺炎克雷伯菌K1株具有较高的抗菌活性;测得肺炎克雷伯菌K1株同时产ESBLs和AmpC酶,所产的ESBLs为CTX-M-14型,所产的AmpC酶为ACT-like衍变型,同时还产TEM-1和SHV-11型广谱β-内酰胺酶。将blaCTX-M-14、blaSHV-11及blaACT-like衍变型的基因序列上传至NCBI获得的基因序列号分别为GU211011、GU211012和GU211014。产CTX-M-14型ESBL基因的质粒接合传递试验结果表明,产CTX-M-14型ESBL基因的阳性菌株能通过质粒接合传递试验传递耐药性,CTX-M-14和TEM-1基因可同时经质粒传递,接合子的耐药表型与供体菌基本保持一致,具有与供体菌相似的耐药表型,仅有个别药物的MIC值较供体菌有所降低。在含头孢噻肟平板上筛选的含CTX-M-14基因片段的阳性转化子对头孢噻肟耐药,而对其它大多数药物表现敏感。产CTX-M-14型ESBL基因的基因环境结果表明,阳性转化子含有2637 bp长度的目的基因序列,经Blast比对得知,该转化子序列的基因环境结构元件包括上游插入序列ISEcp1、-35区和-10区、重复序列IRR、876 bp的CTX-M-14基因开放阅读框及下游插入序列IS903和IRL,将该序列上传至NCBI获基因序列号为HQ650134。TEM-57型β-内酰胺酶特性结果表明,TEM-57型β-内酰胺酶对头孢氨苄的Km值最小,即亲和力最强,对该药物最易水解。舒巴坦和他唑巴坦对阿莫西林的抑酶保护率均最高（分别为87.3%和92.4%）。他唑巴坦对青霉素、阿莫西林、氨苄西林及头孢曲松钠的抑酶保护作用强于舒巴坦,但是他唑巴坦对头孢噻呋钠的抑酶保护作用弱于舒巴坦。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 文献综述
• 1.1 CTX-M 型超广谱β-内酰胺酶及其基因环境概述
• 1.1.1 CTX-M 型ESBLs 的发现
• 1.1.2 CTX-M 型ESBLs 的基本概况
• 1.1.3 CTX-M 型ESBLs 的生化特性与产酶菌的耐药性
• 1.1.4 CTX-M 型ESBLs 的流行病学
• 1.1.5 CTX-M 型ESBLs 基因可在质粒间、质粒和染色体间转移
• 1.1.6 CTX-M 型 ESBLs 的转位因子及基因转移的遗传环境
• 1.1.7 对产CTX-M 型ESBLs 菌株的治疗措施
• 1.2 β-内酰胺酶动力学概述
• 1.2.1 β-内酰胺酶动力学参数
• 1.2.2 β-内酰胺酶动力学性质
• 1.2.3 β-内酰胺酶抑制动力学
• 引言
• 第一章 鸡源肺炎克雷伯菌产β-内酰胺酶的基因型检测
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 培养基及平板的准备
• 1.2.2 临床分离菌的分离培养
• 1.2.3 纯培养细菌的生化鉴定
• 1.2.4 药液、细菌菌液及试剂的配制
• 1.2.5 药物敏感性测定
• 1.2.6 β-内酰胺酶的基因型检测
• 1.2.7 PCR 产物的纯化
• 1.2.8 目的片断的克隆
• 2 结果与分析
• 2.1 临床分离菌的分离培养结果
• 2.2 临床分离菌的生化鉴定结果
• 2.3 药物敏感性测定结果
• 2.4 β-内酰胺酶基因PCR 扩增结果
• 2.5 重组质粒的酶切结果分析
• 2.6 测序结果及基因亚型分析
• 3 讨论
• 3.1 细菌分离鉴定
• 3.2 细菌对药物的敏感性测定
• 3.3 β-内酰胺酶基因型检测
• 第二章 CTX-M-14 型ESBL 基因的基因环境研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 CTX-M-14 型 ESBL 基因的质粒接合传递实验
• 1.2.2 CTX-M-14 型ESBL 的基因环境
• 2 结果与分析
• 2.1 质粒接合传递试验结果分析
• 2.2 接合子质粒及PBR322 载体双酶切结果分析
• 2.3 阳性转化子双酶切鉴定结果分析
• 2.4 耐药表型的测定结果分析
• 2.5 转化子核苷酸序列测定结果分析
• 2.6 含CTX-M-14 型ESBL 的基因上下游分析
• 3 讨论
• 3.1 质粒接合试验
• 3.2 耐药表型的测定
• 3.3 含CTX-M-14 型ESBL 的基因环境
• 第三章 TEM-57 型β-内酰胺酶的酶特性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 克隆表达菌 F4 的大量诱导表达及 β-内酰胺酶提取
• 1.2.2 β-内酰胺类抗生素吸收波长测定与确定
• 1.2.3 TEM-57 型β-内酰胺酶对β-内酰胺类抗生素的水解试验
• 1.2.4 酶抑制剂的抑酶保护试验
• 2 结果与分析
• 2.1 TEM-57 型β-内酰胺酶对β-内酰胺类抗生素的水解试验结果
• 2.2 酶抑制剂的抑酶保护试验结果
• 3 讨论
• 3.1 TEM-57 型β-内酰胺酶
• 3.2 TEM-57 型β-内酰胺酶的水解试验
• 3.3 酶抑制剂的抑酶试验
• 全文结论
• 参考文献
• Abstract