慢性粒细胞白血病细胞eIF4E表达及其调控初步研究

论文摘要

慢性粒细胞白血病（Chonic Myelogenous Leukemia, CML）是一种造血干细胞的恶性克隆性增殖性疾病,其特征性的Ph染色体所形成的bcr-abl融合基因编码BCR-ABL融合蛋白,具有异常的酪氨酸激酶活性,与CML的发病有关。CML按病程可分为慢性期（CP）,加速期（AP）和急变期（BC）。CML急变的分子机制尚不清楚,有研究表明其可能与真核细胞翻译起始因子4E（eukaryotic translation initiation factor-4E,eIF4E）有关。eIF4E在真核细胞帽依赖翻译调节和特定mRNA核浆运输中起重要作用,在很多人类肿瘤中发现eIF4E过表达。在CML中有针对其抑制蛋白4E-BP研究的报道,而对eIF4E的表达和调控机理的关注甚少。已知,在CML中BCR/ABL可通过MAPKERK1/2途径以剂量依赖方式升高RNA结合蛋白K（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K,hnRNP K）水平,CML急变时,有BCR/ABL和hnRNP K的蛋白高表达;已知过表达hnRNP K可通过升高eIF4E mRNA而诱导细胞恶性表型。鉴于此,本课题拟研究CML不同病程病人骨髓标本和CML急变细胞株K562细胞中eIF4E和hnRNP K mRNA表达以及两者的相关性;然后用针对BCR-ABL融合蛋白的酪氨酸激酶抑制剂STI571作用K562细胞,观察eIF4E表达与BCR-ABL融合蛋白的关系;最后用shRNA技术沉默BCR-ABL融合蛋白下游的hnRNP K基因,观察其与白血病细胞的表型变化和eIF4E表达之间的关系,了解hnRNP K在K562细胞中的作用,旨在进一步阐明CML急变机理,为临床治疗CML提供新的分子治疗靶点。实验分三部分研究,主要的方法和结果如下:1. RT-PCR检测25例骨髓细胞[CML急变期（CML-BC）10例,慢性期（CML-CP）8例,加速期1（CML-AP）例,急变期治疗后（CML-BC-R）3例和贫血对照3例]eIF4E mRNA表达,及其中9例CML eIF4E和hnRNP K mRNA表达,并分析两种基因表达相关性。结果发现:与对照组相比,CML-BC和CML-BC-R eIF4E mRNA表达差异有统计学意义（P<0.05）,而CML-CP则没有统计学意义（P>0.05）,hnRNP K与eIF4E mRNA表达呈线性正相关（r=0.79,P<0 .01）。2.用0.0μmol/L,0.5μmol/L,1.0μmol/L,2.5μmol/L,5.0μmol/L STI571处理K562细胞24h,RT-PCR检测eIF4E mRNA表达,发现（0.5～5.0）μmol/L浓度STI571作用能轻微下调K562细胞eIF4E mRNA表达。3. pSuper retro hnRNP K shRNA逆转录病毒载体经转化增菌后提取质粒,HindⅢ/EcorⅠ双酶切鉴定和测序鉴定后,转染PT67细胞包装并收集逆转录病毒上清,感染K562细胞,G418稳定筛选后,分别用流式细胞技术、MTT实验、瑞氏染色和RT-PCR检测细胞周期和细胞凋亡、细胞增殖、细胞形态学以及hnRNP K和eIF4E mRNA表达。结果显示:克隆载体序列正确,与空载对照组相比,hnRNP K干扰组G2/M期细胞比例明显增多（P<0.05）,而细胞凋亡则没有显著变化（P>0.05）,细胞增殖能力降低,双核和多核细胞明显增多（P<0.05）,hnRNP K和eIF4E mRNA表达较空载对照组分别降低了55.22%和55.27%。由此得出以下结论:1. CML急变期骨髓标本和K562细胞eIF4E mRNA和hnRNP K mRNA显著升高,两者呈显著正相关。2. BCR-ABL融合蛋白可能参与调节eIF4E mRNA表达,但是eIF4E调控机理非常复杂,可能还有其它信号通路参与。3. hnRNP K基因沉默能使K562细胞周期阻滞于G2/M期,降低细胞增殖能力,使双核和多核细胞增多,并且下调hnRNP K和eIF4E mRNA表达,但对细胞凋亡没有明显影响。提示hnRNP K可能与细胞周期进展和细胞增殖,细胞分裂有关,也很有可能参与eIF4E转录调控。综上所述,eIF4E基因在CML急变细胞中高表达,BCR-ABL融合蛋白和hnRNP K能影响其表达,同时hnRNP K能通过eIF4E而影响细胞周期,细胞增殖和细胞分裂。本研究有助于进一步探索hnRNP K和eIF4E在CML发病中的作用及相关机制。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 CML患者骨髓和K562细胞eIF4E和hnRNP K mRNA的表达
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第二部分 ST1571 对K562 细胞eIF4EmRNA 表达的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第三部分 hnRNP K shRNA 对K562 细胞表型和eIF4E mRNA 表达的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 附插图
• 文献综述
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录