苏丹红Ⅰ半抗原的改造及其抗体制备

论文摘要

苏丹红作为一种红色染料,常被用于工业方面,研究表明苏丹红Ⅰ对人类具有潜在致癌性,我国和欧盟等都将其作为非法食品添加剂并禁止其用于食品加工,但由于其良好的着色功能,及可以长期保持食物外观鲜亮,且价格便宜,被许多不法分子作为染料用于食品行业。因此,建立一种快速有效检测食品中苏丹红Ⅰ的方法显得尤为重要。我们的研究通过从苏丹红Ⅰ半抗原小分子的改造与合成、人工抗原和包被原的合成与纯化、多克隆抗体和单克隆抗体的制备,到对ELISA检测参数进行一系列的优化,拟建立一种能够快速检测食品中苏丹红的间接竞争酶联免疫吸附检测法。论文研究内容：（1）苏丹红人工抗原及包被原的合成及鉴定我们通过分析苏丹红Ⅰ本身的分子结构设计合成了两种半抗原小分子,对合成的半抗原小分子经过过柱子纯化,并进行质谱鉴定,然后通过DCC/NHS法将他们分别与BSA和OVA进行偶联,其中,BSA偶联物作为人工抗原,OVA偶联物作为包被原,用SDS-PAGE、紫外光谱对偶联物进行鉴定,证明偶联成功,载体蛋白（BSA、OVA）与苏丹红半抗原HaptenX的偶联比分别为1：9和1：6；与Hapten2的偶联比分别为1：30和1：10。（2）免疫及抗血清效价测定将BSA偶联物分别免疫6-8周龄BALB/c雌性小鼠各三只,免疫五次,每次间隔时间14-21天,三次免疫过后尾部取血,ELISA检测抗血清效价,加强免疫过后取血清效价最高的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合,保留血清即多抗,其中Hapten X免疫小鼠抗血清效价明显高于其他两种半抗原,抗血清效价为1：80000；Hapten2抗血清效价1：50000。（3）单克隆抗体的制备及纯化通过血清鉴定选择抗血清效价高的小鼠做融合,通过间接ELISA选择出效价高、分泌能力强单克隆杂交瘤细胞株,然后进行亚克隆挑选稳定的细胞株保存,收集细胞培养上清通过硫酸铵-辛酸进行单克隆抗体粗纯化以备用,通过ELISA检测单抗细胞培养上清效价为1：800。（4） ELISA检测参数的优化不同的检测条件对ELISA检测会有影响,因此我们对ELISA检测参数进行了优化,包括封闭液的选择及浓度、包被液的选择、洗涤缓冲液Tween-20的浓度、包被原浓度、抗体稀释度等,以最终提高ELISA检测灵敏度。主要研究结果：（1）苏丹红改造半抗原小分子制备成功,得到两种苏丹红半抗原Hapten X, Hapten2。（2）半抗原与载体偶联成功,得到两种偶联物：半抗原与BSA的偶联物,半抗原与OVA的偶联物,其中BSA偶联物作为免疫原,OVA偶联物作为包被原。（3）通过细胞融合及亚克隆筛选,得到大量分泌特异性抗Hapten X抗体的杂交瘤细胞株,其细胞培养上清效价达到1：800（4）通过对不同的检测条件ELISA进行研究,最终得到最优检测参数组合：pH9.6的CBS做包被缓冲液、含5%BSA的PBS做封闭液、PBST中Tween-20含量为0.05%、包被原浓度为lug/ml、抗血清稀释20000倍。（5）半抗原与载体之间连接臂的长短影响其抗血清的效价,连接臂长有利于高效价抗体的产生,一般3-5C比较合适。（6）对于苏丹红Ⅰ小分子来说,其含有的羟基官能团对于其抗体的识别其关键作用,我们实验设计直接通过其羟基引入羧基,然后再偶联到载体蛋白上,多抗效价较高,但单抗对于苏丹红Ⅰ识别效果一般。（7）采用注射器助推要比超声和研磨乳化效果好。（8） Hapten2多抗对于苏丹红IC50为0.34ng/ml。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 缩略词索引
• 1 综述
• 1.1 苏丹红的性质及危害
• 1.2 苏丹红捡测方法的研究进展
• 1.2.1 仪器检测
• 1.2.2 化学发光检测
• 1.2.3 免疫学检测
• 1.3 单克隆抗体研究进展
• 1.4 研究目的和内容
• 2 实验方法与结果
• 2.1 试剂和仪器
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 苏丹红半抗原的制备、纯化及鉴定
• 2.2.2 半抗原与载体蛋白偶联物的制备、纯化及鉴定
• 2.2.3 免疫原的乳化
• 2.2.4 实验小鼠免疫
• 2.2.5 免疫小鼠的抗血清效价测定
• 2.2.6 单克隆抗体制备
• 2.2.7 单克隆抗体的SDS-PAGE
• 2.2.8 抗体特性测定
• 2.2.9 ELISA检测参数的优化
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 苏丹红半抗原的合成及鉴定
• 2.3.2 半抗原载体蛋白偶联物的鉴定
• 2.3.3 免疫小鼠的抗血清效价测定
• 2.3.4 ELISA检测体系的优化
• 2.3.5 单克隆抗体制备
• 2.3.6 抗体特性测定
• 3 讨论
• 3.1 苏丹红半抗原改造
• 3.2 半抗原与载体偶联方式的选择
• 3.3 免疫剂量的选择
• 3.4 抗血清的制备
• 3.5 人工抗原与佐剂的乳化及乳化效果
• 3.6 细胞融合
• 3.7 杂交瘤细胞的筛选及亚克隆
• 3.8 检测参数的优化
• 参考文献
• 附录
• 致谢