CaHPR1在CaRop1调控的植物抗逆反应中的作用分析

论文摘要

高温高湿的环境常常伴随着严重的病虫灾害,植物在长期的适应过程中,必然进化出了协同的防御反应机制。ROP基因是植物的多功能分子开关,在植物体中起着重要的信号代谢调控作用,迄今已有许多报道说明其在植物逆境胁迫以及激素应答上的功能作用。羟基丙酮酸还原酶（HPR）是植物光呼吸过程中的关键酶之一,在光呼吸及光合作用相关过程中具有重要的作用,有报道说明其受光、植物激素、植物衰老的调控,以及可能参与了植物的抗病防御反应。本研究着眼于辣椒在高温耐受性和病害抵抗能力间的协同作用,以前期对CaRop1开展大量的功能研究以及机理研究的基础上,通过分析CaHPR1与CaRop1的相互作用、CaHPR1的亚细胞定位、CaHPR1的组织特异性以及初步研究其在植物中的功能,从而将CaHPR1、CaRop1与植物耐高温和抗病防御反应联系起来,研究CaHPR1在CaRop1调控的植物抗逆反应中的作用,主要的结果有:1、通过反向酵母双杂交、植物体内荧光双分子互补实验（BIFC）验证CaHPR1与CaRop1的相互作用发现CaHPR1与DN-CaRop1（失活态）相互作用,与CA-CaRop1（激活态）没有相互作用。2、成功构建了 CaHPR1、DN-CaRop1和CA-CaRop1原核表达载体并成功诱导表达,为下一步开展体外互作试验、酶活测定等奠定基础。3、通过分析CaHPR1的序列结构与蛋白结构得出其具有典型的NAD（H）结合结构域,C末端具有SKL微体定位信号。4、成功构建了CaHPR1的亚细胞定位载体pMDC83-CaHPR1,并通过基因枪轰击转化洋葱表皮细胞,荧光显微镜观察发现其定位于细胞膜内膜,少量分散在细胞内膜周围,进一步证实了CaHPR1与CaRop1相互作用的可能性。5、通过RT-PCR和RT-FQ-PCR的方法分析CaHPR1在植物组织中的分布情况,发现其主要分布于植物的叶片中,而在植物的根部没有检测出来,实验的结果与已经发表的报道一样,CaHPR1作为光呼吸过程中的关键酶,主要存在于植物的叶片和子叶中。6、成功构建了功能获得性超表达CaHPR1基因载体并成功转化烟草（K326）,T0代植株开展初步的功能分析得到,CaHPR1在植物高温耐受力方面具有一定的作用;成功构建了CaHPR 功能缺失VIGS载体,并成功转化辣椒幼苗,瞬间表达结果表明了CaHPR 功能缺失体TRV::CaPR1在高温胁迫下比较敏感,进一步验证了CaHPR 在植物高温耐受力方面的作用。通过本研究我们验证了 CaHPR1与DN-CaRop1间的相互作用,通过组织特异性分析以及蛋白的亚细胞定位分析,初步了解了 CaHPR1的基本信息,进一步指导后续实验的开展,通过初步的功能分析,证明了CaHPR 与植物高温耐受力相关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 “全球气候变暖”大背景下植物抗逆研究的意义
• 1.2 ROP类基因的概述及其在植物抗逆反应中的作用
• 1.3 HPR基因的概述及其在植物抗逆反应中的作用
• 1.4 本课题研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 CaHPR1与CaROP1两种形态突变体互作的验证
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 反向酵母双杂交验证CaHPR1与DN-CaRop1、CA-CaRop1的互作关系
• 2.1.4 CaHPR1、DN-CaRop1和CA-CaRop1原核表达载体的构建
• 2.1.4.1 引物设计
• 2.1.4.2 原核表达载体的构建
• 2.1.5 BIFC验证CaHPR1与DN-CaRop1、CA-CaRop1的互作关系
• 2.1.5.1 载体构建
• 2.1.5.2 基因枪轰击洋葱表皮细胞并观察
• 2.1.6 CaHPR1序列分析及蛋白结构功能预测
• 2.2 CaHPR1的亚细胞定位
• 2.2.1 菌株与质粒
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 CaHPR1的组织特异性分析
• 2.3.1 植物材料
• 2.3.2 引物设计
• 2.3.3 实验方法
• 2.4 CaHPR1在植物中的功能初步分析
• 2.4.1 植物材料
• 2.4.2 菌株和质粒
• 2.4.3 主要试剂
• 2.4.4 超表达CaHPR1转基因烟草以及基因功能的初步分析
• 2.4.4.1 超表达载体的构建
• 2.4.4.2 TO代转基因烟草的初步功能分析
• 2.4.5 VIGS分析辣椒幼苗中CaHPR1基因的功能
• 2.4.5.1 载体构建
• 2.4.5.2 农杆菌介导转化辣椒幼苗以及瞬间表达情况分析
• 2.4.5.3 VIGS辣椒幼苗高温处理后表型变化的分析
• 3 结果与分析
• 3.1 CaHPR1与CaROP1两种形态突变体相互作用的验证
• 3.1.1 反向酵母双杂验证CaHPR1与DN-CaRop1、CA-CaRop1的互作关系
• 3.1.2 CaHPR1、DN-CaRop1和CA-CaRop1原核表达载体的构建
• 3.1.3 BIFC验证CaHPR1与DN-CaRop1、CA-CaRop1的互作关系
• 3.1.4 CaHPR1序列分析及蛋白结构功能预测
• 3.2 CaHPR1的亚细胞定位
• 3.3 CaHPR1的组织特异性分析
• 3.4 CaHPR1在植物中的功能初步分析
• 3.4.1 T0代超表达CaHPR1转基因植株叶片的高温耐受性分析
• 3.4.2 VIGS分析辣椒幼苗中CaHPR1基因的功能
• 4 讨论
• 4.1 CaHPR1与CaROP1两种形态突变体的相互作用关系
• 4.2 CaHPR1的亚细胞定位
• 4.3 CaHPR1表达的组织特异性
• 4.4 CaHPR1在植物体中的功能
• 参考文献
• 附录
• 致谢