论文摘要
目的：通过GnRHa对雌绵羊生殖免疫调节的系列实验研究,探讨促性腺激素释放激素类似物（GnRH-A）对动物生殖免疫的调节的作用和机理,为动物临床和生产实践科学运用提供依据。方法：（1）以EDC.HCL为偶合剂,将GnRHa阿拉瑞林（Alarelin）与BSA连接为复合物,再加入弗氏不完全佐剂制成抗原乳剂。（2）将42只5-6月龄雌绵羊随机分为6组（n=7）,即实验Ⅰ组（EG-Ⅰ）、实验Ⅱ组（EG-Ⅱ）、实验Ⅲ组（EG-Ⅲ）、实验Ⅳ组（EG-Ⅳ）、实验Ⅴ组（EG-Ⅴ）和对照组（CG）。在各实验组（EGs）动物皮下注射不同剂量的阿拉瑞林抗原。于0、7、14、21、28、35、45、60、70d采血分离血清,用间接ELISA法测定GnRH抗体浓度与血清GnRH浓度。（3）于70d无菌摘取子宫与卵巢,用免疫组织化学SP法染色,然后用图像分析技术进行定位与分析。（4）于70d无菌切取腺垂体提取垂体总RNA, PCR扩增,反转录,用实时荧光定量PCR分析垂体中GnRHR mRNA的表达。（5）应用DNAMAN、Tmpred、SignalP3.0、TargetP1.1、Expasy、PSORTⅡprediction等生物信息学分析软件和在线工具,对GnRHR序列和蛋白的理化特性、跨膜结构、信号肽、细胞定位、二级和三级结构特征等进行分析和预测。结果：（1）制备的GnRHa抗原为乳白色均匀悬液,物理化学性状稳定良好,安全可靠,无任何不良反应。（2） GnRH抗体浓度进行了有规律的表达,实验组血清GnRH抗体浓度都是先上升后下降,其中EG-Ⅰ、EG-Ⅱ、EG-Ⅲ在21d达到峰值,EG-Ⅳ6和EG-Ⅴ则在35d达到峰值。实验组血清GnRH浓度在免疫后45d之内持续下降,EG-Ⅰ、EG-Ⅱ在28d达到谷值,EG-Ⅲ、EG-Ⅳ和EG-V则在45d达到谷值,且以EG-Ⅴ为最低。谷值之后逐渐上升趋势,70d时达到免疫注射前水平。（3）卵巢和子宫均有GnRHR阳性细胞分布,阳性细胞主要见于卵母细胞、卵泡细胞、子宫内膜上皮细胞和腺上皮细胞,GnRHa的注射剂量不同GnRHR阳性细胞的染色强度也不同,染色强度越大,相应受体的表达水平就越高,但是两者分布和定位的数量并非完全一致,GnHRa对在GnRHR卵巢与子宫中的分布具有影响。（4）实验组GnRHR的2-（ΔΔct）值均低于对照组,EG-Ⅳ和EG-Ⅴ的GnRHR mRNA的2-（ΔACt）值低于EG-Ⅰ和EG-Ⅱ（P<0.05）。（5）GnRHR基因扩增产物2027bp,编码产物为疏水性跨膜蛋白,无明显的信号肽,二级结构主要以a-螺旋为主,并主要在内质网中发挥生物学作用,跨膜区域分为跨膜域、胞外域和胞内域3部分。序列分析表明,GnRHR编码产物主要具有运载体功能,在离子跨膜与信号传递过程中发挥重要作用,并对绵羊的激素调节有影响。结论：（1）GnRHa（阿拉瑞林，Alarelin）抗原具有良好的免疫原性,为了延续抗体的高峰水平,有必要加强免疫。（2）绵羊体内注射GnRHa可以明显提高GnRH抗体浓度,降低血中GnRH浓度。（3）卵巢和子宫都有GnRHR阳性细胞分布,GnRHa主动免疫对在卵巢与子宫中GnRHR的表达水平具有增强作用。（4）阿拉瑞林免疫可以降低垂体GnRHR基因表达,增加注射剂量和注射次数作用更明显。（5） GnRHR是一种不稳定的疏水性跨膜蛋白,具有明显的生物信息学特征。
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