论文摘要
海南省东风螺（Babylonia）养殖产业近年来日益壮大,已成为海南省海水养殖的一个新兴产业,养殖规模与产量居全国之首。目前,养殖生态环境质量的恶化、养殖生态系统的不稳定以及养殖病害频发,已经严重威胁到东风螺养殖产业的发展、壮大。越来越多的研究证明：在微观上,养殖系统内微生物种类和群落结构的稳定对养殖生物健康、病害预防至关重要,同时系统中的微生物特别有益微生物的种类、数量及其群落组成结构在维护养殖系统的稳定过程中扮演着不可替代的角色。本研究采用PCR-DGGE以及序列分析技术,对不同生长发育时期东风螺养殖系统内和海南方斑东风螺（Babylonia areolata）幼螺病池内的微生物种类与群落组成结构进行了研究分析。首先,改进建立了适合东风螺养殖系统内沉积物中微生物宏基因组DNA提取方法,即采用化学变性、酶消化、PVP沉淀、PEG纯化相结合,从沉积物中分离提取到高质量的微生物宏基因组DNA；其次,设计合成了真细菌16S rDNA通用引物对GC+968F/1401R和弧菌16S rDNA通用引物对GC+VF169/VR774,分别扩增真细菌与弧菌的16S rDNA目标片段；设计合成细菌16S rDNA通用引物对11f/1492r和硝化细菌16S rDNA通用引物GC+Eub338fa/Ntspa685r分别用作巢式PCR反应第一、二轮PCR反应引物扩增系统内硝化细菌的16S rDNA目标片段：设计合成真菌18S rDNA通用引物GC+NS5/NS6扩增系统内真菌的18SrDNA目标片段；再有,利用银染显色技术,分别构建了真细菌、硝化细菌和弧菌16SrDNA目标片段与真菌18SrDNA目标片段的PCR-DGGE指纹图谱,与传统显影方法相比,灵敏度更高,图谱中的条带数目更多。通过回收变性梯度凝胶中的16SrDNA与18SrDNA目标片段,PCR克隆、连接转化、测序和序列BLAST分析等一系列研究发现：东风螺养殖生态系统内的真细菌主要有21种不同类型,基本属于a-Proteobacteria、γ-Proteobacteria、ε-Proteobacteria、Bacteroidetes和Uncultured bacterium等；弧菌的重要种类15种,它们主要属于Vibrio splendidus、Vibrio alginolyticus、Vibrio xuii、Vibrio mediterranei、Vibrio sp.、Vibrio brasiliensis、Vibrio harveyi和Vibrio coralliilyticus;硝化细菌9种,主要属于Uncultured Nitrospirae bacterium、Uncultured deep-sea bacterium、Nitrospira sp和Uncultured Nitrospira sp.;真菌6种,它们属于数据库目前还未分离培养的真菌类。对不同类型养殖生态环境系统内沉积物中的微生物种类、群落结构分别进行研究统计的结果表明：海南泥东风螺（Babylonia lutosa）成螺养殖池内沉积物中微生物种类主要有Uncultured bacterium、Uncultured epsilon proteobacterium、Arcobacter sp.、Uncultured alpha proteobacterium、Sulfitobacter sp.、Rhodobacterales bacterium、Vibrio sp.、Vibrio splendidus、Vibrio alginolyticus、Vibrio xuii、Vibrio mediterranei、Vibrio harveyi、Vibrio coralliilyticus、Uncultured deep-sea bacterium、Uncultured Nitrospirae bacterium和Nitrospira sp等菌属；泰国方斑东风螺成螺池内沉积物中微生物种类主要有Uncultured bacterium、Uncultured epsilon proteobacterium、Arcobacter sp.、Uncultured alpha proteobacterium、Sulfitobacter sp.、Rhodobacterales bacterium、Vibrio sp.、Vibrio splendidus、Vibrio alginolyticus、Vibrio xuii、Vibrio mediterranei、Vibrio harveyi、Vibrio coralliilyticus、Uncultured Nitrospirae bacterium、Uncultured deep-sea bacterium和Nitrospira sp等菌属；海南方斑东风螺亲螺池内沉积物中微生物种类主要有Uncultured bacterium、Uncultured epsilon proteobacterium、Arcobacter sp.、Uncultured alpha proteobacterium、Sulfitobacter sp.、Rhodobacterales bacterium、Mucus bacterium、Uncultured Ruegeria sp.、Alpha proteobacterium、Vibrio sp.、Vibrio splendidus、Vibrio alginolyticus、Vibrio xuii、Vibrio mediterranei、Vibrio harveyi、Vibrio coralliilyticus、Uncultured deep-sea bacterium、Uncultured Nitrospirae bacterium和Nitrospira sp,等菌属；海南方斑东风螺成螺池内沉积物中微生物种类主要有Uncultured bacterium、Uncultured epsilon proteobacterium、Arcobacter sp、Uncultured alpha proteobacterium、Sulfitobacter sp.、Rhodobacterales bacterium、Vibrio sp.、Vibrio splendidus、Vibrio alginolyticus、Vibrio xuii、Vibrio mediterranei、Vibrio harveyi、Vibrio coralliilyticus Uncultured Nitrospirales bacterium、Uncultured Nitrospirae bacterium和Nitrospira sp.等菌属；泰国方斑东风螺亲螺池内沉积物中微生物种类主要有Uncultured bacterium、Uncultured epsilon proteobacterium、Arcobacter sp.、Uncultured alpha proteobacterium、Sulfitobacter sp. Rhodobacterales bacterium、Gamma proteobacterium、Vibrio sp.、Vibrio splendidus、Vibrio alginolyticus、Vibrio xuii、Vibrio mediterranei、Vibrio harveyi、Vibrio coralliilyticus、Uncultured Nitrospirae bacterium、Uncultured deep-sea bacterium和Nitrospira sp等菌属；海南方斑东风螺幼螺池内沉积物中微生物种类主要有Uncultured bacterium、Uncultured epsilon proteobacterium、Arcobacter sp.、Uncultured alpha proteobacterium、Sulfitobacter sp.、Rhodobacterales bacterium、Roseobactergallaeciensis、Vibrio sp.、Vibrio splendidus、Vibrio alginolyticus、Vibrio xuii、Vibrio mediterranei、Vibrio harveyi、Vibrio coralliilyticus、Uncultured Nitrospirae bacterium、Uncultured deep-sea bacterium和Nitrospira sp等菌属；海南方斑东风螺幼螺病池内沉积物中微生物种类主要有Uncultured bacterium、Uncultured epsilon proteobacterium、Arcobacter sp.、Uncultured alpha proteobacterium、Sulfitobacter sp., Rhodobacterales bacterium、Vibrio sp.、Vibrio splendidus、Vibrio alginolyticus、Vibrio xuii、Vibrio mediterranei、Vibrio harveyi、Vibrio coralliilyticus、Uncultured Nitrospirae bacterium、Uncultured deep-sea bacterium和Nitrospira sp等菌属。对不同类型养殖生态环境系统内水体中的微生物种类、群落结构分别进行研究统计的结果表明：海南方斑东风螺幼螺池内水中微生物种类的主要Uncultured bacterium、Uncultured epsilon proteobacterium、Arcobacter sp.、Uncultured alpha proteobacterium、Sulfitobacter sp.、Rhodobacterales bacterium、Gaetbulibacter saemankumensis、Flavobacterium sp.、Gamma proteobacterium、Roseobacter gallaeciensis、Vibrio sp.、Vibrio splendidus、Vibrio alginolyticus、Vibrio xuii、Vibrio mediterranei、Vibrio harveyi、Vibrio coralliilyticus、Uncultured Nitrospirae bacterium. Uncultured deep-sea bacterium和Nitrospira sp.等菌属；海南方斑东风螺成螺池内水体中的微生物种类主要有Uncultured bacterium、Uncultured epsilon proteobacterium、Arcobacter sp.、Uncultured alpha proteobacterium、Sulfitobacter sp.、Rhodobacterales bacterium、Gamma proteobacterium、Vibrio sp.、Vibrio splendidus、Vibrio alginolyticus、Vibrio xuii、Vibrio mediterranei、Vibrio harveyi、Vibrio coralliilyticus、Vibrio brasiliensis、Uncultured Nitrospirae bacterium、Uncultured deep-sea bacterium和Nitrospira sp.等菌属；海南方斑东风螺孵化池内水体中的微生物种类主要有Uncultured bacterium、Uncultured epsilon proteobacterium、Arcobacter sp.、Uncultured alpha proteobacterium、Sulfitobacter sp.、Rhodobacterales bacterium、Gamma proteobacterium、Vibrio sp.、Vibrio splendidus、Vibrio alginolyticus、Vibrio xuii、Vibrio mediterranei、Vibrio harveyi、Vibrio coralliilyticus、Uncultured Nitrospirae bacterium、Uncultured deep-sea bacterium、Nitrospira sp和Uncultured Nitrospira sp等菌属；海南方斑东风螺产卵池内水体中的微生物种类主要有Uncultured bacterium. Uncultured epsilon proteobacterium、Arcobacter sp.、Uncultured alpha proteobacteri-um、Sulfitobacter sp.、Rhodobacterales bacterium、Gamma proteobacterium、Flexibacter sp.、Flavobacterium sp.、Gaetbulibacter saemankumensis、Mucus bacterium、Alpha proteobacterium、Vibrio sp., Vibrio splendidus、Vibrio alginolyticus、Vibrio xuii、Vibriomediterranei、Vibrio harveyi、Vibrio coralliilyticus、Uncultured Nitrospirae bacterium、Uncultured deep-sea bacterium、Nitrospira sp和Uncultured Nitrospira sp等菌属；泰国方斑东风螺亲螺池内水体中的微生物种类主要有Uncultured bacterium、Uncultured epsilon proteobacterium、Arcobacter sp.、Uncultured alpha proteobacteri-um、Sulfitobacter sp.、Rhodobacterales bacterium、Mucus bacterium、Alpha proteobacterium、Vibrio sp.、Vibrio splendidus、Vibrio alginolyticus、Vibrio xuii、Vibrio mediterranei、Vibrio harveyi、Vibrio coralliilyticus、Uncultured Nitrospirae bacterium、Uncultured deep-sea bacterium、Nitrospira sp和Uncultured Nitrospira sp等菌属；海南方斑东风螺亲螺池内水体中的微生物种类主要有Uncultured bacterium、Uncultured epsilon proteobacterium、Arcobacter sp.、Uncultured alpha proteobacteri-um、Sulfitobacter sp.、Rhodobacterales bacterium、Mucus bacterium、Alpha proteobacterium、Vibrio sp.、Vibrio splendidus、Vibrio alginolyticus、Vibrio xuii、Vibrio mediterranei、Vibrio harveyi、Vibrio coralliilyticus、Uncultured Nitrospirae bacterium、Uncultured deepsea bacterium、Nitrospira sp和Uncultured Nitrospira sp等菌属。此外,在本研究中,通过对海南方斑东风螺幼螺病池的沉积物中微生物种类组成结构研究发现,确实也存在有大量具有致病潜能的病原菌类,但它们与东风螺幼螺发病之间的关系还有待进一步的探索。