莱克多巴胺单克隆抗体的制备及其CiELISA检测方法的建立

论文摘要

莱克多巴胺（Ractopamine, RAC）属β2-肾上腺素受体激动剂,临床上主要用于治疗支气管哮喘、支气管痉挛和产科疾病。莱克多巴胺与克伦特罗一样,能改变养分的代谢途径,促进动物体蛋白质沉积,同时抑制脂肪的合成和积累,最终改变胴体品质,加快动物的生长速度。然而,高剂量的RAC对动物有一定的毒副作用,人体食用了高RAC残留的动物性食品后,也会产生毒副作用。欧盟早已明确禁止在食用性动物中使用包括莱克多巴胺在内的所有p-肾上腺素兴奋剂类药物,美国虽允许使用,但对用量和操作程序有严格规定。中国也明文禁止使用,但生猪生产中非法使用RAC的现象仍很严重。国内外已经建立了多种检测RAC残留的理化检测方法,如HPLC和GC-MS等,这些方法虽然准确、敏感、有效,但均需要昂贵的仪器、专业的操作技能和复杂的样品前处理程序,且费时,不适合用于大批量样品的检测。ELISA方法是目前检测该药物最普遍的方法,具有快速、灵敏、操作简单和一次检测样品量大的特点,且样品前处理过程相对简单,检测结果与HPLC、GC-MS检测有较高致性,因而常用作筛查方法。本研究以单克隆抗体和酶联免疫吸附测定技术为基础,研制出针对RAC的单克隆抗体,并初步建立了检测RAC的间接竞争酶联免疫吸附法（CiELISA）。添加回收试验证明,建立的检测RAC残留的CiELISA可以用于样品残留的检测。1.RAC人工抗原的合成与鉴定。分别采用多元酸酐与混合酸酐联用法和碳二亚胺法将RAC与载体蛋白偶联,制备人工抗原RAC-BSA、RAC-HSA,通过紫外扫描和免疫学方法初步鉴定偶联成功。通过对比实验,选择RAC-BSA作为免疫原,RAC-HSA为包被原。2.RAC单抗的制备。用合成的RAC-BSA常规免疫BALB/c小鼠,五免后血清效价达1：32,000以上。利用单克隆抗体技术和酶免疫学检测方法筛选获得1株可持续分泌针对莱克多巴胺抗体的杂交瘤细胞株5D7。体内诱生法制备了抗RAC的腹水,蛋白浓度为21.3mg/mL,腹水效价为1：128,000。3.ELISA检测方法的建立。用5D7杂交瘤细胞株制备的抗RAC腹水制作RAC标准竞争曲线,线性方程为Y=-0.4095x+0.7134（R2=0.991）,IC50为4.75ng/mL,LOD低于0.5ng/mL,LOQ为0.92ng/mL。特异性实验表明,该单抗对RAC的抑制率为100%,对其它一些p-兴奋剂的抑制率均小于0.1%。4.添加回收实验。将建立的CiELISA检测方法应用于猪肝的添加回收试验。当样品液作4倍以上稀释时,样品基质干扰基本消失。在0-50ng/mL范围内,曲线方程为：Y=-0.3972x+0.7237,相关系数R2=0.9892,IC50为5.31ng/g,LOD为0.41ng/g。用1、2、5、10、20、50ng/mL的莱克多巴胺标准液做添加回收试验,经检测肝脏中药物回收率在80%～100%之间,批内差异在3.28%～9.37%之间,批间差异在4.57%～10.27%之间。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 符号说明
• 前言
• 2-肾上腺素受体激动剂与瘦肉精'>1 β₂-肾上腺素受体激动剂与瘦肉精
• 2 莱克多巴胺概述
• 2.1 莱克多巴胺的理化性质
• 2.2 莱克多巴胺的的药理学与毒理学
• 3 莱克多巴胺检测方法研究进展
• 3.1 色谱分析法
• 3.2 免疫分析法（IA）
• 4 本研究的目的及意义
• 实验一 莱克多巴胺人工抗原的制备及鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 主要试剂
• 1.2 仪器与耗材
• 1.3 主要溶液系统
• 1.4 莱克多巴胺人工抗原的制备
• 1.5 人工抗原的鉴定
• 1.6 人工抗原蛋白质浓度的测定
• 2 结果
• 2.1 人工抗原的紫外扫描
• 2.2 免疫学方法鉴定
• 2.3 人工抗原蛋白质浓度测定
• 3 讨论
• 3.1 偶联方法的选择
• 3.2 载体蛋白的选择
• 3.3 人工抗原的纯化及鉴定
• 实验二 莱克多巴胺单克隆抗体的制备及其ELISA检测方法的建立
• 1 材料和方法
• 1.1 实验动物及生物材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 仪器与耗材
• 1.4 主要溶液系统
• 1.5 单克隆抗体的制备
• 1.6 单克隆抗体性质的鉴定
• 1.7 ELISA检测方法的建立
• 2 结果
• 2.1 包被抗原的工作浓度、阳性血清效价及最佳封闭液的确定
• 2.2 单克隆抗体细胞株的建立和稳定性
• 2.3 腹水的制备
• 2.4 单克隆抗体的鉴定
• 2.5 抗原抗体最佳工作浓度的确立
• 2.6 CIELISA标准工作曲线及相关参数
• 3 讨论
• 3.1 免疫方式
• 3.2 细胞融合、培养和筛选
• 3.3 封闭液的确定
• 3.4 抗体制备及鉴定
• 实验三 莱克多巴胺单抗的初步应用
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 仪器与试剂
• 1.3 样品添加回收试验
• 2 结果
• 2.1 样品基质干扰
• 2.2 样品溶液中标准曲线的绘制
• 2.3 添加回收率及重复性
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢