鸡毒霉形体黏附素特性鉴定及其鸡胚组织互作蛋白的分布研究

论文摘要

鸡毒霉形体（Mycoplasma gallisepticum,MG）是鸡慢性呼吸道病的病原菌。本病在世界各地的鸡群中普遍存在,给养禽业造成严重的经济损失。许多研究表明,MG通过表面的黏附素（Protein Mycoplasma Gallisepticum Adheain,pMGA）与鸡呼吸道粘膜表面的受体结合而侵染宿主。为了阐明pMGA的结构、功能及其在鸡毒霉形体感染中的分子致病机制,本研究鉴定了鸡毒霉形体黏附素特性、探讨了pMGA与宿主受体分子的相互作用及受体在鸡组织中的分布规律,为进一步研究鸡体内pMGA受体基因的类型、分子结构及作用方式奠定了基础,取得了如下结果。1.鸡毒霉形体黏附素特性鉴定通过生物学软件及相关在线分析工具,对pMGA进行基于氨基酸序列的生物信息学分析,包括蛋白质理化特性、功能域、磷酸化位点、基序及空间结构等。分析表明,pMGA1.2主要在细胞外发挥生物学作用,分子量64.9kD,理论等电点为5.58,半衰期体外培养的哺乳动物网状细胞为30h,酵母菌体内20h以上,大肠杆菌体内10h以上;a螺旋占26.59%,主要存在于210位氨基酸之前;β折叠占23.08%,存在于210位氨基酸之后,无规卷曲占50.33%,该蛋白为稳定的球状蛋白质;pMGA1.2分子有6类基序模式,53个基序位点和21个抗原决定簇,而且有4处具有明显的卷曲螺旋;pMGA1.2含有5个结构域,分别为蛋白家族Mycohaema结构域、2个FIVAR结构域、C末端有1个甲基化-DNA-蛋白半胱氨酸甲基转移酶结构域和1个半乳糖结合区;pMGA1.2属于霉形体血凝素超家族的一员,与霉形体R株黏附蛋白相似度高达99%。2.鸡毒霉形体黏附素截短蛋白及全蛋白表达产物免疫学特性鉴定对pMGA1.2和pMGAⅣ片段基因原核表达条件进行优化,获得了pMGA1.2及pMGAⅣ可溶性表达的最佳条件。pMGA1.2表达量在裂解液全菌体和上清液中分别达18.5%和17%,pMGAⅣ表达量在裂解液全菌体和上清液中分别达28%和18%。采用GST亲和层析柱纯化pMGA1.2及pMGAⅣ,纯度达95%左右。免疫印迹结果表明,pMGA1.2和pMGAⅣ融合蛋白能与兔源鸡毒霉形体阳性血清发生特异性免疫反应,出现明显的显色条带;空载体对照无显色条带;表明本实验所获得的pMGA1.2及pMGAⅣ融合蛋白均具有良好的免疫学活性。3.免疫荧光检测pMGA受体在鸡胚组织中的分布用蛋白酶thrombin切去融合蛋白pMGA1.2的GST标签,获得纯化的pMGA1.2,建立了检测鸡胚组织中pMGA受体的间接免疫荧光组织化学方法。将20日龄SPF鸡胚的气管、心、肺、肝、肾、十二指肠、法氏囊、腺胃、胸腺和脾脏等组织制成石蜡切片,采用纯化的pMGA1.2与各组织作用,用兔源的MG阳性血清和FITC标记的羊抗兔IgG来检测受体分布。结果表明:除脾脏外,其他组织中均出现明亮的特异性荧光,说明这些组织可能均存在能与pMGA1.2特异性结合的蛋白即受体蛋白。其中,pMGA的受体分布于气管和十二指肠的纤毛上皮细胞,肺脏的肺泡上皮细胞,法氏囊盲突的淋巴小结的皮质区,胸腺的皮质部,腺胃的粘膜层,肝脏、心脏及肾脏中pMGA受体的位置暂时无法确定。4.鸡胚组织膜蛋白与鸡毒霉形体黏附素特异结合的研究采用差速离心提取鸡胚组织膜蛋白,经处理后固定于硝酸纤维素膜上。以纯化的pMGA1.2及pMGAⅣ为“靶蛋白”,用兔源MG阳性血清与羊抗兔酶标IgG检测鸡胚各组织中是否存在能与pMGA反应的组织蛋白;SDS-PAGE分析组织膜蛋白。结果表明,除脾脏外,其他组织中均存在与pMGA1.2和pMGAⅣ特异结合的膜蛋白,其中分子量为36.5kD或（和）27.2kD的蛋白可能是pMGA1.2的受体,pMGAⅣ是与受体结合的肽段。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1 前言
• 2 霉形体的研究历史
• 3 霉形体的细胞生物学特征
• 3.1 菌落形态及培养特性
• 3.2 细胞结构
• 3.3 生态学特征
• 4 鸡毒霉形体
• 4.1 鸡毒霉形体的研究历史
• 4.2 鸡毒霉形体的生化特性及抵抗力
• 4.3 鸡毒霉形体的致病力
• 5 鸡慢性呼吸道病的流行病学及发病特点
• 5.1 鸡慢性呼吸道病的流行病学
• 5.2 鸡慢性呼吸道病的发生特点
• 6 MG感染的免疫机制
• 7 鸡慢性呼吸道疾病的发病机理
• 8 鸡慢性呼吸道病的临床症状和病理变化
• 8.1 鸡慢性呼吸道病的临床症状
• 8.2 鸡慢性呼吸道病的病理变化
• 9 鸡毒霉形体的膜蛋白
• 10 鸡毒霉形体的结构蛋白
• 11 鸡毒霉形体黏附蛋白的研究
• 11.1 鸡毒霉形体黏附蛋白的研究历史
• 11.2 pMGA基因序列与功能的研究
• 11.3 pMGA对MG免疫逃逸的作用
• 11.4 pMGA基因的表达调控
• 12 鸡慢性呼吸道病防治
• 12.1 疫苗免疫
• 12.2 药物防治
• 13 微生物受体研究及应用
• 13.1 微生物与受体的关系
• 13.2 不同微生物会选择同一受体
• 13.3 同一病毒可与一个以上受体结合
• 13.4 不同科的微生物选择不同的受体,同一属的微生物选择不同的受体
• 13.5 微生物与受体的相互作用启动了微生物的生命循环
• 13.6 受体的研究方法
• 14 PMGA与宿主相互作用的研究
• 15 动物微生物受体的研究意义
• 16 生物信息学在微生物研究中的应用
• 研究的目的与意义
• 第二章 鸡毒霉形体黏附素特性鉴定
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 pMGA1.2的物理及化学特性分析
• 2.2.2 pMGA1.2的疏水性
• 2.2.3 pMGA1.2的亚细胞定位
• 2.2.4 PMGA1.2的蛋白质卷曲螺旋分析
• 2.2.5 pMGA1.2的基序（Motif）分析
• 2.2.6 pMGA1.2的抗原决定簇分析
• 2.2.7 pMGA1.2的低复杂区分析
• 2.2.8 pMGA1.2的二级结构
• 2.2.9 pMGA1.2的三级结构
• 2.2.10 pMGA1.2的结构功能域分析
• 2.2.11 pMGA1.2的序列比对
• 2.2.12 pMGA1.2的保守区域分析
• 3 结果与分析
• 3.1 pMGA1.2的物理及化学特性
• 3.2 pMGA1.2的疏水性分析
• 3.3 pMGA1.2的理化性质综合分析
• 3.4 pMGA1.2的亚细胞定位分析
• 3.5 pMGA1.2的基序（Motif）分析
• 3.6 pMGA1.2的抗原决定簇分析
• 3.7 pMGA1.2的低复杂度区域
• 3.8 pMGA1.2的二级结构
• 3.8.1 HNN算法分析
• 3.8.2 Chou&Fasman方法分析
• 3.9 pMGA1.2的相关序列搜索结果
• 3.10 pMGA1.2的蛋白超家族分析
• 3.11 pMGA1.2的三级结构预测
• 3.12 pMGA1.2的结构功能域分析
• 4 讨论
• 4.1 蛋白质的理化特性
• 4.2 亚细胞定位
• 4.3 基序分析
• 4.4 pMGA1.2的抗原决定簇及疏水性分析
• 4.5 二级结构分析
• 4.6 蛋白三级结构分析
• 5 结论
• 第三章 鸡毒霉形体黏附素截短蛋白及全蛋白表达产物免疫学特性鉴定
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 菌种、阳性血清
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要试剂的配制
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 细菌的复苏与扩大培养
• 2.2.2 pMGA1.2及pMGA Ⅳ片段的表达
• 2.2.3 培养温度和培养时间
• 2.2.4 IPTG浓度
• 2.2.5 培养基的pH值
• 2.2.6 可溶性表达的培养时间
• 2.2.7 pMGA Ⅳ及pMGA 1.2的纯化
• 2.2.8 蛋白质的SDS-PAGE检测
• 2.2.9 表达产物的Western-blot检测
• 2.2.10 蛋白浓度的确定
• 3 结果与分析
• 3.1 诱导温度和诱导时间对pMGA 1.2及pMGAⅣ表达量的影响
• 3.2 培养基pH值对pMGA 1.2及pMGAⅣ表达量的影响
• 3.3 诱导时间对pMGA1.2及pMGAⅣ可溶性表达量的影响
• 3.4 IPTG浓度对pMGA1.2及pMGAⅣ可溶性表达量的影响
• 3.5 pMGA1.2及pMGAⅣ融合蛋白的纯化及免疫原性分析
• 3.6 蛋白浓度
• 4 讨论
• 4.1 SDS-PAGE电泳
• 4.2 诱导温度对pMGA1.2及pMGAⅣ融合蛋白表达量的影响
• 4.3 培养基pH值及诱导时间对pMGA1.2及pMGAⅣ蛋白表达量的影响
• 4.4 诱导时间对pMGA1.2及pMGAⅣ融合蛋白表达量的影响
• 4.5 IPTG浓度对pMGA1.2及pMGAⅣ表达量的影响
• 5 结论
• 第四章 免疫荧光检测PMGA受体在鸡胚组织中的分布
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 主要试剂及配制
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 融合蛋白pMGA1.2切割及免疫活性检测
• 2.2.2 组织包埋
• 2.2.3 间接免疫荧光试验最佳条件的确定
• 2.2.4 间接免疫荧光的步骤
• 2.2.5 特异性实验
• 2.2.6 重复性实验
• 2.2.7 免疫组化结果的判定
• 3 结果与分析
• 3.1 pMGA1.2的SDS-PAGE分析
• 3.2 免疫学活性分析
• 3.3 间接免疫荧光检测鸡胚组织中pMGA受体方法的建立及优化
• 4 讨论
• 5 结论
• 第五章 鸡胚组织膜蛋白与鸡毒霉形体黏附素特异结合的研究
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 主要试剂
• 2.2 主要溶液的配制
• 2.2.1 匀浆缓冲液及膜蛋白提取缓冲液
• 2.2.2 ELISA及Dot-ELISA检测所用溶液的配制
• 2.2.3 非变性凝胶电泳（PAGE）所需溶液
• 2.2.4 复性相关缓冲液
• 2.2.5 SDS-PAGE分析
• 2.3 不同组织膜蛋白的提取
• 2.3.1 组织膜蛋白的提取方法
• 2.3.2 几种表面活性剂对气管膜蛋白溶解能力的影响
• 2.3.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.3.4 SDS-PAGE及转印结合实验
• 2.3.5 复性处理后的western-blot
• 2.3.6 Dot-ELISA方法及结果判定
• 2.3.7 最佳反应条件的选择
• 2.3.8 特异性试验
• 2.3.9 重复性试验
• 2.3.10 pMGA与细胞膜结合的饱和试验
• 3 结果与分析
• 3.1 4种表面活性剂对鸡胚气管膜蛋白的溶解
• 3.2 细胞膜的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.3 10种组织膜蛋白的SDS-PAGE及Western-blot鉴定
• 3.4 复性后的Western-blot
• 3.5 间接Dot-ELISA的最佳工作条件
• 3.5.1 各组织的Dot-ELISA
• 3.5.2 截短蛋白pMGAⅣ的Dot-ELISA
• 3.5.3 特异性及重复性试验
• 3.5.4 pMGA与膜蛋白结合的饱和试验
• 4 讨论
• 5 结论
• 第六章 结语
• 1 结论
• 2 创新点
• 参考文献
• 附录 在读期间发表的相关研究论文
• 致谢