多环芳烃降解菌的降解特性与降解途径研究

论文摘要

多环芳烃（PAHs）是一类广泛分布于海洋环境中的典型的持久性有机污染物（POPs）,通过食物链的传递会对生态环境和人体健康造成极大危害。了解PAHs在环境中的来源、分布、归宿及去除问题,已成为当今环境科学研究的前沿课题。生物降解是环境（土壤,沉积物,水体）中PAHs去除的最主要途径。研究其遗传控制方式,探索代谢途径,是为了更好地将降解菌应用于有效而可控的生物修复之中。本论文将采集自厦门博坦油码头的海水样品,在持续性的高浓度、高分子量PAHs选择压力下进行富集驯化,获得高分子量PAHs的降解混合菌系,并以此讨论高分子量多环芳烃（HMW-PAHs）降解菌的筛选策略;同时对筛选获得的2株能高效降解PAHs的细菌从生理生化角度、基因组学、蛋白质组学方面进行较为系统的研究,探讨其降解特性,解析相关功能基因及功能酶,并在这些基础上推测其代谢途径。获得的主要结果如下:1.用高浓度（1000 mg/L）,混合PAHs（菲,芘,荧蒽,苯并（a）芘）作为选择压力,从采自石油污染地区样品中驯化获得混合降解菌系,从中分离得到3株可培养单菌,变性梯度凝胶电泳（PCR—DGGE）跟踪分析驯化过程中的细菌群落结构变化及优势菌形成过程。采用高效液相色谱（HPLC）测定混合菌系BL和3株单菌BL01,BL02,BL03对高分子量、难降解的PAH——苯并（a）芘的降解能力,结合DGGE结果分析菌系中各单菌在降解过程中的作用。结果显示BL02,BL03不具有降解BaP的能力,BL01 14 d后降解了20.98%,三菌混合培养物降解了22.61%;而混合菌系BL 14天后降解了44.07%的BaP,这在同类报道中处于较高水平,显示了BL对BaP有较好的降解能力。该筛选策略有助于关注那些未可培养细菌在HMW-PAHs降解中的作用,因此采用高浓度、高分子量PAHs的选择压力筛选HMW-PAHs的降解菌是一种快速而行之有效的筛选策略。2.对采自厦门海域的水样和沉积物样品,经过一定时间的PAHs富集培养之后,采用改良的平板升华法成功地筛选到两株菲高效降解菌,降解能力测定显示,它们都能以菲和荧蒽作为唯一碳源生长,72 h后均能完全降解起始浓度为100mg/L的菲。16S rDNA鉴定结果显示这两株分别为鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.B2-7和分支杆菌Mycobacterium sp.S8。3.通过降解菌对芳香烃化合物和PAHs降解过程中常见中间产物的利用情况,菌株B2-7能利用水杨酸,2—萘酚,邻苯二酚,初步推测它以水杨酸途径代谢菲,菌株S8不能降解萘,能利用原儿茶酸,但是不能利用邻苯二甲酸,很可能是以邻苯二甲酸以外的途径代谢菲。降解菌降解荧蒽的优化条件实验结果显示,非离子表面活性剂Tween-80和营养物葡萄糖能促进菌株B2-7和S8对荧蒽的降解。4.芳环羟基化双加氧酶和芳环断裂双加氧酶是PAHs降解过程中开环的两种关键酶,其中环羟基化双加氧酶（RHDs）控制苯环加氧,是微生物降解反应的限速步骤,邻苯二酚双加氧酶是催化苯环开裂的重要酶。我们通过引物设计的方法,从降解菌Sphingomonas sp.B2-7中扩增得到全长的邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因（C23O）和环羟基化双加氧酶大亚基（phnA）,从分子生物学角度证明了PAHs降解过程中的重要酶系邻苯二酚-2,3-双加氧酶（C23O）和环羟化双加氧酶基因α亚基（phnA）在菌株B2-7中的存在。对phnA基因构建了重组表达载体,成功在表达宿主大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中进行表达,基因在宿主中以溶解蛋白形式存在。可以进一步推断菌株B2-7降解菲的基本途径是RHDs氧化PAHs形成二氢二醇PAHs化合物,再在C23O的作用下经由水杨酸途径间位裂解（meta-cleavage）苯环,生成2-羟基粘康酸半醛（2-HMS）。5.采用1-DE（一向凝胶电泳）和2-DE（双向凝胶电泳）结合LC-MS/MS（串联质谱）,研究菌株B2-7在菲诱导与无菲诱导（对照）状况下的蛋白质表达,对差异蛋白的生物质谱结果进行分析,得到多个代谢途径中的关键酶（加氧酶、脱氢酶、醛缩酶等）,结合菌株B2-7的降解特性与降解基因的研究结果,最终推导出菌株B2-7降解菲较为完整的代谢途径。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 PAHs的危害及在环境中的分布
• 1.1 PAHs的危害
• 1.2 环境中的PAHs
• 2 PAHs污染环境的生物修复
• 2.1 降解PAHs的微生物
• 2.2 影响微生物修复PAHs污染的因子
• 2.3 高分子量PAHs的生物降解
• 3 PAHs降解的分子生态学研究
• 3.1 降解菌多态性分析方法
• 3.2 微生物群落结构分析方法
• 4 PAHs降解的分子生物学水平研究
• 4.1 PAHs降解的基因组学研究
• 4.2 PAHs降解的代谢组学研究
• 4.3 PAHs降解的蛋白质组学研究
• 5 本论文的研究内容及意义
• 参考文献
• 第二章 PAHs降解菌的筛选
• 1 材料和方法
• 1.1 样品来源
• 1.2 主要材料
• 1.3 基本方法
• 1.4 系统发育树的构建
• 2 结果
• 2.1 改良平板升华法筛选菲降解菌
• 2.2 高分子量PAHs混合菌系的筛选
• 3 讨论
• 3.1 PAHs降解菌的富集培养与筛选
• 3.2 降解PAHs的细菌
• 4 小结
• 参考文献
• 第三章 混合菌对高分子量PAHs的降解研究
• 1 材料和方法
• 1.1 样品来源
• 1.2 主要材料
• 1.3 基本方法
• 1.4 系统发育树的构建
• 2.结果
• 2.1 高浓度、高分子量PAHs胁迫下BL混合菌系群落结构变化
• 2.2 DGGE条带分子鉴定
• 2.3 混合菌BL对苯并[a]芘的降解能力测定
• 2.4 菌株BL01,BL02,BL03的降解谱分析
• 3 讨论
• 3.1 混合菌系对HMW-PAHs的降解
• 3.2 微生物对环境污染物的响应
• 4.小结
• 参考文献
• 第四章 PAHs降解菌的降解特性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株
• 1.2 主要材料
• 1.3 基本方法
• 2 结果
• 2.1 生理生化特征
• 2.2 对菲、荧蒽的降解能力测定
• 2.3 菌株B2-7和S8降解芳香烃化合物的降解谱
• 2.4 菌株B2-7和S8降解荧蒽的条件优化
• 3 讨论
• 3.1 PAHs降解菌
• 3.2 微生物降解HMW-PAHs的条件优化
• 4 小结
• 参考文献
• 第五章 降解机制研究——降解菌的基因组学研究
• 1 材料与方法
• 1.2 主要材料
• 1.3 基本方法
• 2 结果
• 2.1 底物利用的降解途径推测
• 2.2 邻苯二酚2,3-双加氧酶（C23O）基因的获得
• 2.3 环羟化双加氧酶基因（phnA）的克隆与表达
• 2.4 基因序列的提交
• 3 讨论
• 3.1 细菌代谢菲的途径
• 3.2 细菌代谢PAHs的重要酶系
• 4 小结
• 参考文献
• 第六章 降解机制研究——降解菌的蛋白质组学分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验菌株
• 1.2 主要材料
• 1.3 基本方法
• 2 结果
• 2.1 菲诱导的菌株B2-7菌体全蛋白SDS-PAGE电泳
• 2.2 双向电泳研究菲诱导表达蛋白
• 2.3 蛋白质的鉴定
• 3 讨论
• 3.1 细菌全蛋白提取方法
• 3.2 与PAHs代谢相关的蛋白质鉴定
• 3.3 菌株B2-7降解菲的代谢途径
• 4 小结
• 参考文献
• 第七章 结论与展望
• 1 结论
• 2 本论文创新点
• 3 展望
• 附录
• 附录一 参与的科研课题、发表和待发表的学术论文
• 附录二 载体图谱
• 附录三 细菌电镜照片
• 附录四 缩略语对照表
• 致谢