H9N2亚型禽流感病毒中国大陆早期分离株内部基因的序列分析及对鸡的致病性实验

论文摘要

H9N2亚型禽流感病毒（AIV）在中国、东南亚及世界许多国家分布广泛,中国大陆1994年首次公开报道从鸡群中分离到H9亚型AIV,随后便在一些地区形成小规模的流行,未波及全国。但1998年春夏开始的H9亚型禽流感在短短的几个月时间内就形成波及20多个省区的全国范围大流行,给我国的养禽业造成了巨大的经济损失。其对养禽业的严重危害性和公共卫生意义一直倍受学者们的关注。为研究H9N2亚型禽流感病毒传播途径的分子机制,本实验选择H9N2亚型AIV中国大陆早期分离株A/Chicken/Guangdong/SS/94（H9N2）（简称SS株）和2001年流行时期的分离株A/Chicken/Shanghai/7/01（H9N2）（简称62株）为研究对象,对SS株进行内部基因全长序列测定和遗传进化分析同时比较了它和62株对4周龄SPF鸡的致病性。1 H9N2亚型禽感病毒SS株内部基因的序列分析选择H9N2亚型分离株A/Chicken/Guangdong/SS/94（C/GD/SS/94）,根据已发表的序列和Hoffmann通用引物,设计扩增基因的引物对,提取基因组RNA,用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增6个片段并测序。所测序列与从GenBank中获取的部分H9N2亚型毒株的基因序列比较分析结果如下:C/GD/SS/94的所有内部基因与C/BJ/1/94的同源率均高,为95.7%～99.4%,说明该毒株与我国同期分离株C/BJ/1/94有共同的来源;与香港早期分离株C/HK/739/94相比,内部基因同源率为96.2%～99.3%,说明两者关系密切;与香港1997年活禽市场上流行的H9N2 AIV的代表株D/HK/Y280/94相比,各基因同源率均高,为96.8%～98.2%,说明它们之间在遗传演化地位上关系密切,同属于H9N2亚型AIV欧亚分支中的类C/BJ/1/94亚分支;与同期香港活禽市场上的另一流行株C/HK/G9/97相比,只有PB1基因同源性较低90.6%,其它基因同源性相对较高96.9%～98.5%。C/GD/SS/94与Q/HK/Gl/97内部基因同源性的范围在90.3%95.7%。除M基因同源性略高为95.7%外,其他内部基因均在91.0%以下。而Q/HK/Gl/97与香港人感染H5N1和H9N2亚型AIV密切相关,它与1997年人源H5N1毒株HK/481/97的6个内部基因间同源率均达98%。C/GD/SS/94的6个基因均不在G1分支上。因此C/GD/SS/94不同于Q/HK/G1/97,与香港流感事件没有直接关系。其6个内部基因在进化树上与C/GD/5/97共处同一分支。通过内部全基因同源性比较可知,C/GD/SS/94与C/GD/5/97各个内部全基因同源性都达99.5%以上。说明C/GD/5/97内部基因很可能来源于C/GD/SS/94。2 H9N2亚型AIV对4周龄SPF鸡的致病性实验为研究H9N2亚型禽流感病毒的传播与复制特性,选用两株H9N2亚型AIV,在已知其中一株H9N2亚型AIV SS株的传播特性的基础上,以其为参照,通过比较两株H9N2亚型AIV在致病性方面的差异来推断62株的传播特性。将种毒经同一批10日龄SPF鸡胚扩增,收集含病毒的尿囊液,经HA和HI实验后,置于-70℃冰箱备用。接种前将种毒作1/10稀释后,按200μl/只的接种剂量,采用滴鼻、点眼和气管接种的方法对4周龄的SPF鸡进行致病性实验。接种后,注意观察鸡群,记录临床症状和发病情况,并分别在接种后的3、5、7、9、11天各组分别扑杀2只鸡。分别采取气管、肺、肾脏、小肠、肝脏、胰腺、脾脏等脏器,以10%中性福尔马林溶液固定;制作石蜡切片,部分经HE染色后在光学显微镜下直接观察病变;部分用免疫组织化学的方法,检测两株H9N2亚型AIV抗原的动态分布,免疫组化检测发现,SS株仅在肾脏能检测到抗原,而62株仅能从肺脏中检测到抗原。

论文目录

摘要

Abstract

符号说明

文献综述

1 A型流感病毒的形态结构及分类

2 H9N2亚型禽流感病毒的进化及分子流行特点

3 内部基因产物与流感病毒的毒力

4 H9N2亚型禽流感病毒的检测及防控

5 H9N2亚型禽流感病毒与人类的关系

6 参考文献

第一章 H9N2亚型禽流感病毒内部基因的克隆测序和序列分析

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

5 参考文献

第二章 H9N2亚型禽流感病毒对4周龄SPF鸡的致病性实验

1 材料与方法