表达猪轮状病毒VP4基因和共表达VP4与LTB重组乳酸菌表达系统的构建及其免疫学评价

论文摘要

猪轮状病毒是无囊膜、分节段的双股RNA病毒,隶属于呼肠孤病毒科,是引起仔猪腹泻的重要病原之一。猪轮状病毒感染呈世界范围分布,给养猪业带来了极大的危害。本研究以乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000和干酪乳杆菌Lactobacillus casei ATCC 393（L.casei 393）作为递呈抗原的活菌载体,以猪轮状病毒主要免疫保护性抗原VP4蛋白的基因片段为靶基因,并插入大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基因（LTB）,构建了表达猪轮状病毒VP4基因和共表达VP4-LTB的重组乳酸乳球菌表达系统和干酪乳杆菌表达系统,并对免疫效果进行比较分析。根据目的基因和融合表达载体质粒的特点,应用oligo6.0软件进行设计引物。以VP4-pGEX-6P-1质粒作为模板,通过PCR扩增得到大约756 bp的VP4基因,以pMD-18T-LTB质粒作为模板,通过PCR扩增得到大约375 bp的LTB基因,PCR产物经酶切后,与带有粘性末端的pNZ8112载体连接,得到pNZ8112-VP4和pNZ8112-VP4-LTB的质粒。重组质粒pNZ8112-VP4和pNZ8112-VP4-LTB分别电转化乳酸乳球菌NZ9000 ,得到重组菌pNZ8112-VP4和pNZ8112-VP4-LTB,然后将重组菌进行酶切、PCR鉴定和测序分析。以同样方法得到pPG-1-VP4和pPG-1-VP4-LTB重组菌,然后进行酶切、PCR鉴定和测序分析。构建的重组菌pNZ8112-VP4和pNZ8112-VP4-LTB在GM17培养液中培养,通过Nisin来诱导目的蛋白的表达。重组菌中蛋白的表达和定位通过SDS-PAGE、Western blotting和免疫荧光进行鉴定。考马斯亮蓝染色结果显示:pNZ8112-VP4和pNZ8112-VP4-LTB的菌体裂解物分别表达了27KD和40KD的融合蛋白,而诱导前的菌体没有目的蛋白表达。诱导后表达的VP4和VP4-LTB蛋白经Western blotting分析,可检测到27KD和40KD的特异性反应条带,诱导前的菌体没有相应的条带出现。这些结果表明Nisin能有效诱导乳酸乳球菌NZ9000中异源蛋白的表达。采用抗VP4的鼠血清进行免疫荧光试验的结果显示,pNZ8112-VP4和pNZ8112-VP4-LTB诱导后的菌体表面能看到黄绿色荧光,而诱导前的菌体则没有荧光反应,且细胞被伊文思蓝染成红色。构建的重组菌pPG-1-VP4和pPG-1-VP4-LTB在MRS培养液中进行培养,利用乳糖来诱导目的蛋白的表达。重组菌目的蛋白的表达和定位也是通过SDS-PAGE、Western blotting和免疫荧光来鉴定。考马斯亮蓝染色可看到pPG-1-VP4和pPG-1-VP4-LTB的菌体裂解物分别有大约40KD和53KD的蛋白表达,而未诱导的菌体中没有蛋白表达。通过Western blotting检测诱导后的菌体裂解物,可看到40KD和53KD的特异性反应条带,而未诱导的菌体则没有相应的条带出现,这些结果表明乳糖能有效诱导L.casei 393中异源蛋白的表达。通过间接免疫荧光方法鉴定,pPG-1-VP4和pPG-1-VP4-LTB的菌体表面均能看到黄绿色荧光,而未诱导的菌体则没有荧光反应,且细胞被伊文思蓝染成红色。为检验重组菌是否能诱导黏膜和系统免疫应答,将BALB/c小鼠分为六组,通过口服途径分别免疫pPG-1 , pPG-1-VP4 , pPG-1-VP4-LTB , pNZ8112 , pNZ8112-VP4和pNZ8112-VP4-LTB。每只小鼠分别免疫109 c.f.u.单位的重组菌,每次连续免疫三天,第一次加强免疫在第一次免疫后的17、18、19天,第二次加强免疫在第一次免疫后的33、34、35天。每次免疫后的第7天收集小鼠血清;每次免疫后的1、2、7天收集粪便;眼洗液是在每次免疫后的第7天以50μL的PBS冲洗眼结膜获得;阴道洗液是在每次免疫后的第7天用200μL的PBS冲洗阴道获得;母鼠分娩后的3、5、7天收集乳汁。所有收集的样品保存于–20℃备用。为保持黏膜系统的稳定,许多防御机制都参与进行持久有效地作用。分泌性IgA的参与也是防御机制之一,IgA抗体通过阻止病原微生物的入侵和定植并竞争受体和代谢底物。为评价黏膜免疫反应,通过ELISA方法来检测黏膜样品中特异性IgA抗体的水平。在粪便、眼洗液和阴道洗液中我们检测到了高水平的特异性IgA,与对照组相比差异显著。其中免疫pPG-1-VP4的小鼠中特异性IgA抗体水平高于免疫pNZ8112-VP4的小鼠,免疫pPG-1-VP4-LTB的小鼠中特异性IgA抗体水平也高于免疫pNZ8112-VP4-LTB的小鼠,这是因为L.casei 393同Lactococcus lactis NZ9000相比具有更好的肠道定植能力。免疫pPG-1-VP4-LTB和pNZ8112-VP4-LTB的小鼠粪便、眼洗液和阴道样品中IgA抗体水平均高于免疫pPG-1-VP4和pNZ8112-VP4的小鼠。这是由于添加了黏膜免疫佐剂LTB的缘故,表明LTB能加强黏膜系统反应。具有低免疫原性的疫苗尤其需要强有力的佐剂来加强抗原递呈,本研究证明LTB作为一种安全有效的佐剂具有极大的潜力。免疫pPG-1-VP4和pPG-1-VP4-LTB的小鼠血清中IgG的效价相当,但都高于免疫pPG-1的对照组。免疫pNZ8112-VP4和pNZ8112-VP4-LTB的小鼠血清中IgG抗体的效价相当,但都高于免疫pNZ8112的对照组。在本研究中,口服免疫表达VP4和VP4-LTB的重组乳酸菌不仅能诱导产生黏膜免疫,而且诱导产生了系统免疫。通过口服免疫产生的黏膜免疫反应不只局限于胃肠道,也引起了其他黏膜部位的免疫反应。IgA抗体能和抗原结合并阻止其进入,降低炎性反应的程度,从而阻止了对组织的损伤,通过分泌性IgA抗体在黏膜表面对病原体进行排斥和清除,这对预防轮状病毒感染是至关重要的。将新分离的免疫鼠脾细胞稀释成5×106个/ mL并培养66h,分别用0.5μg/mL,5μg/mL和25μg/mL的VP4抗原进行刺激,收获培养上清用于检测细胞因子。脾淋巴细胞的增殖通过ELISA进行检测,结果表明0.5μg/mL和5μg/mL的VP4与25μg/mL的VP4相比,具有更强的刺激增殖作用。IL-4和IFN-γ的检测采用Biosource检测试剂盒,方法参照说明书。结果表明免疫组中IL-4和IFN-γ的分泌显著高于对照组,组间差异显著,且分泌IL-4的水平显著高于IFN-γ。这些数据表明,通过口服途径免疫重组菌后引起了显著的细胞因子反应,从而加强了抵抗轮状病毒感染的保护作用。免疫母鼠产仔后的3、5、7天收集乳汁,通过ELISA方法检测乳汁中的特异性抗体,结果显示乳汁样品中有较高水平的特异性IgA,表明免疫重组菌产生的抗体对于幼龄动物的被动免疫保护有一定作用。综上所述,本研究所获得的结果表明,乳酸乳球菌和干酪乳杆菌可用做口服免疫传递抗原引起黏膜和系统免疫。乳酸菌作为疫苗传递载体能够定植于不同的黏膜部位,例如胃肠道、生殖道等,可被用于接种在病原体入侵的部位来抵抗感染。乳酸菌安全无毒的特点使它们更适合于用做口服疫苗载体来传递异源抗原,重组乳酸菌具有较好的免疫原性,并能引起较好的黏膜免疫反应和系统免疫反应。当VP4蛋白与LTB共表达时,加强了黏膜免疫反应,LTB具有较好的免疫原性、抗原性和佐剂特性,可被用于基因工程疫苗的研制,很适合于用做黏膜疫苗的免疫佐剂。本研究为进一步研究新型、有效的猪轮状病毒口服疫苗奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 研究的目的和意义
• 1.2 猪轮状病毒感染及病原学研究进展
• 1.2.1 猪轮状病毒感染历史及危害性
• 1.2.2 轮状病毒免疫相关基因及其编码蛋白
• 1.2.3 轮状病毒疫苗的研究进展
• 1.3 乳酸菌用作口服疫苗传递载体的研究进展
• 1.3.1 乳酸菌的益生作用
• 1.3.2 乳酸菌对机体免疫作用的影响
• 1.3.3 乳球菌表达系统研究进展
• 1.3.4 乳酸杆菌表达系统研究进展
• 1.4 LT 作为黏膜免疫佐剂的研究进展
• 1.4.1 大肠杆菌不耐热肠毒素（LT）的黏膜免疫佐剂活性
• 1.4.2 LT 作为黏膜免疫佐剂的应用
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 质粒、菌种和毒株
• 2.1.2 实验动物
• 2.1.3 引物合成
• 2.1.4 培养基的配制
• 2.1.5 溶液的配制
• 2.1.6 间接ELISA 检测抗体主要试剂
• 2.1.7 蛋白质免疫印迹（Western-blot）主要试剂
• 2.1.8 酶类及主要生化试剂
• 2.1.9 主要实验仪器与设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 表达VP4 与VP4-LTB 重组乳酸乳球菌的构建
• 2.2.2 目的基因在乳酸乳球菌中的表达
• 2.2.3 表达VP4 与VP4-LTB 重组干酪乳杆菌的构建
• 2.2.4 目的基因在干酪乳杆菌中的表达
• 2.2.5 口服重组乳酸菌免疫学指标的测定
• 2.2.6 病毒中和活性检测
• 3 实验结果
• 3.1 表达VP4 与VP4-LTB 重组乳酸乳球菌的构建
• 3.1.1 目的基因的PCR 扩增结果
• 3.1.2 表达载体pNZ8112 的鉴定结果
• 3.1.3 重组乳酸乳球菌表达载体pNZ8112-VP4 的鉴定结果
• 3.1.4 重组乳酸乳球菌表达载体pNZ8112-VP4-LTB 的鉴定结果
• 3.2 目的基因VP4 与VP4-LTB 在乳酸乳球菌中的表达
• 3.2.1 SDS-PAGE 鉴定结果
• 3.2.2 Westen-blot 鉴定结果
• 3.2.3 间接免疫荧光鉴定结果
• 3.3 表达VP4 与VP4-LTB 重组干酪乳杆菌的构建
• 3.3.1 目的基因的PCR 扩增结果
• 3.3.2 表达载体pPG-1 的鉴定结果
• 3.3.3 重组干酪乳杆菌表达载体pPG-1-VP4 的鉴定结果
• 3.3.4 重组干酪乳杆菌表达载体pPG-1-VP4-LTB 的鉴定结果
• 3.4 目的基因VP4 与VP4-LTB 在干酪乳杆菌中的表达
• 3.4.1 SDS-PAGE 鉴定结果
• 3.4.2 Westen-blot 鉴定结果
• 3.4.3 间接免疫荧光鉴定结果
• 3.5 重组菌口服免疫小鼠免疫学指标的测定
• 3.5.1 免疫小鼠血清中特异性抗体IgG 测定
• 3.5.2 小鼠粪便中特异性IgA 检测结果
• 3.5.3 小鼠眼洗液中特异性sIgA 检测结果
• 3.5.4 小鼠阴道洗液中特异性sIgA 检测结果
• 3.5.5 乳汁中特异性sIgA 检测结果
• 3.6 脾淋巴细胞增殖试验及细胞因子的检测
• 3.6.1 脾淋巴细胞增殖试验结果
• 3.6.2 细胞因子检测结果
• 3.7 抗体中和效价检测结果
• 4 讨论
• 4.1 乳酸乳球菌和干酪乳杆菌活菌载体表达猪轮状病毒免疫保护性基因作为口服疫苗的设计思路
• 4.2 猪轮状病毒VP4 基因作为外源基因在重组乳酸菌中的表达及表达效果分析
• 4.3 LTB 作为佐剂对口服免疫后黏膜免疫效果的影响
• 4.4 口服重组乳酸菌免疫效果的评价
• 4.4.1 口服免疫后黏膜免疫应答和系统免疫应答的效果分析
• 4.4.2 乳酸乳球菌和干酪乳杆菌作为口服疫苗活菌载体的比较
• 4.4.3 口服免疫重组乳酸菌后对细胞免疫的影响
• 4.4.4 口服免疫重组乳酸菌后母源抗体的检测分析
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读博士学位期间发表的论文