人肝癌细胞中Tec表达及磷酸化水平的初步研究

论文摘要

背景和目的:原发性肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是常见的恶性肿瘤,肝切除术仍是目前最有效的根治性手段,但大部分患者由于伴有严重的肝功不全或远处转移不适合进行手术切除或肝移植治疗[1]。而现有的化疗药物选择性不高,毒副反应明显,至今也没有标准的系统性化疗方案,放射治疗由于适应征有限效果也欠佳[2-3]。因此,具有特异性强、疗效显著、毒副作用小等优点的分子靶向治疗成为目前原发性肝癌治疗研究的热点和希望之一,更深入地探索HCC致癌的分子机理,明确肝癌发生、增殖、侵袭与转移过程中关键的信号转导分子及其相互作用,寻找重要的关键信号蛋白分子靶点具有重要意义[4]。肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor,HGF）又名离散因子（Scatter Factor,SF）,是一种很强的刺激肝细胞增殖的丝裂原。其单一受体c-Met是一跨膜蛋白,由原癌基因c-met编码[5]。HGF/c-Met可通过影响肿瘤细胞间粘附、促进细胞外基质（ECM）降解、增强肿瘤细胞运动能力、参与肿瘤血管生成等多种途径参与肝癌的发生发展[6],肿瘤细胞发生的这一系列生物学效应与HGF激活c-Met,导致ras/致分裂素激活蛋白（MAP）激酶、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B等信号转导途径的级联激活密切相关[7]。Tec是否参与肝癌细胞中HGF信号分子转导调控过程目前尚不清楚。Tec（tyrosine kinase expressed in hepatocellular carcinoma）是最初从肝癌组织中筛选得到的一种存在于胞质内的非受体型蛋白酪氨酸激酶,是多种细胞因子、辅助分子及受体型蛋白酪氨酸激酶信号转导途径中的重要连接分子[8]。一方面,Tec能够对受体型蛋白酪氨酸激酶（包括生长因子受体、细胞因子受体、G蛋白耦联受体、抗原受体）传导的各种胞外刺激做出反应,同时可被多种非受体型蛋白酪氨酸激酶调节,如Src、JAK、Syk和FAK家族激酶等[9]。另一方面,Tec参与调节多种信号传导路径,包括磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-K）通路、磷脂酶C（PLC ）通路以及蛋白激酶C（PKC）通路[10]。在本课题中,我们旨在通过研究人正常肝、癌旁肝及肝癌组织中Tec（tyrosine kinase expressed in hepatocellular carcinoma）的表达及磷酸化水平,以及人肝癌细胞HepG2中Tec磷酸化与HGF分子信号转导相互之间的关联,同时初步探讨具体的作用机理,证实Tec的表达尤其是磷酸化水平异常与肝癌的发生发展密切相关,抑制Tec的表达或直接下调其磷酸化水平可能部分逆转肝癌细胞的恶性生物学行为。方法:1.利用组织芯片技术结合免疫组化法（SP法）检测肝癌组织、癌旁肝组织、正常肝组织中Tec的表达及其磷酸化水平。2.利用免疫沉淀实验检测HGF刺激肝癌细胞株HepG2不同时间后Tec、Src的磷酸化表达水平。3.利用Western Blot方法检测Src特异性抑制剂PP2、BTK抑制剂特异性LFM分别处理HepG2前后以及HGF刺激不同时间后重要的Tec相关信号蛋白分子PY20、FAK、Erk1/2、STAT3、Raf的磷酸化表达水平。结果:1.Tec在肝癌组织及非癌组织中阳性表达率无明显差异,但在肝癌组织中的染色程度显著高于非癌组织,且与组织分级有关（P<0.05）。Tec磷酸化水平在肝癌组织中高于癌旁组织及正常肝组织（均P<0.05）。2.随HGF刺激时间的延长,Tec、Src在HepG2中的磷酸化表达水平逐渐增强,呈现时间依赖性。3.随HGF刺激时间的延长,Raf在HepG2中的磷酸化表达水平并无增强,PY20、FAK、Erk1/2、STAT3的磷酸化表达水平逐渐增强,呈现时间依赖性,Src抑制剂PP2及BTK抑制剂LFM对Raf、Erk1/2磷酸化表达水平无明显抑制效应,对PY20、FAK、STAT3的磷酸化表达水平呈现部分抑制效应。结论:1.Tec的表达异常与肝癌的发生发展密切相关,抑制Tec的表达或直接下调其磷酸化水平可能影响肝癌的进程。2.首次证实Tec参与了人肝癌细胞中HGF分子信号转导调控过程。3.Tec是HGF分子信号转导过程中重要的信号连接和调控分子。4.在HGF分子信号转导调控过程中,Tec与FAK、Src、STAT3等信号蛋白分子存在“cross-talk”,Tec可通过不同信号转导分子和途径调节肝癌细胞分子信号转导的调控。

论文目录

• 英文缩写一览表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 论文正文 人肝癌细胞中Tec 表达及磷酸化水平的初步研究
• 前言
• 第一部分 原发性肝癌中Tec 表达及磷酸化水平的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 肝癌细胞中Tec 磷酸化参与HGF 分子信号转导的调控研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 全文总结
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述一 FAK—原发性肝癌分子靶向治疗的新希望
• 参考文献
• 文献综述二 原发性肝癌分子靶向治疗的进展
• 参考文献
• 硕士期间撰写发表的文章