疏水作用层析及其渗透质辅助包涵体蛋白质复性的研究

论文摘要

包涵体蛋白质体外折叠复性是基因工程下游的瓶颈之一，采用传统的稀释复性方法复性包涵体蛋白质容易形成聚集体和错配体，复性后的蛋白质很难在高浓度下得到高活性回收率。本论文的目的在于利用疏水作用层析技术开发一种新的疏水作用层析辅助包涵体蛋白质复性方法，实现蛋白质在高浓度下的高活性和高回收率。 本论文分为四个部分。第一部分对复合干扰素的稀释复性条件及复性方法进行了优化，考察了聚乙二醇、甘油等渗透质以及Butyl FF、Phenyl FF、Poros ET和Poros PE等疏水层析介质作为添加剂对复合干扰素稀释复性的影响，总结出Poros ET／10％PEG混合体系为最佳，复性蛋白收率为74.6％，比活为2.61×108U／mg，分别高于对照组的45.4％和2.1×108U／mg。第二部分应用反相高效液相层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、氧化型／还原型SDS-PAGE电泳以及质谱二硫键定位等方法对稀释复性复合干扰素的各构型体进行分析，建立了反相高效液相层析方法检测复合干扰素错配体、可溶聚集体和活性体（正确折叠体）模型。第三部分为复合干扰素的疏水作用层析复性研究。直接采用蛋白质分离纯化用的商业疏水作用层析方法不能有效地辅助蛋白质正确折叠，导致较低的活性收率和不可逆性吸附；在流动相中添加恒定浓度的渗透质聚乙二醇和应用一过性高浓度盐酸胍洗脱，一方面可以避免不可逆性吸附，另一方面可以抑制聚集体的产生，使蛋白质回收率达到70％以上，但由于形成了较高比例的错配体，使蛋白活性不高，并且复性效果明显受到上样量的限制使复性蛋白质浓度偏低。论文的一个主要贡献是根据疏水作用层析的特点，发展了一种新型的梯度增高聚乙二醇浓度和梯度降低盐酸胍浓度的双梯度疏水作用层析复性包涵体蛋白质的方法。应用现代的层析工作软件很容易完成各种浓度梯度的洗脱策略，这种梯度增高聚乙二醇浓度和梯度降低盐酸胍浓度的双梯度疏水层析辅助复性模式显示出优越性，可以获得高蛋白质浓度下的高比活性和高蛋白回收率。吸附于层析柱上的变性复合干扰素在周围溶液不断而温和变化的复性环境中逐渐被正确折叠和洗脱下来。对于各种影响因素如：盐酸胍初浓度、盐酸胍浓度梯度、聚乙二醇终浓度、聚乙二醇浓度梯度和梯度洗脱流速也进行了考察。采用优化的复性条件可以获得蛋白质收率为84％，蛋白质比活为7.9×108U／mg，蛋白质浓度为620ug／ml的复合干扰素，实现了包涵体变性蛋白质在高浓度下的高效复性。论文的第四部分为粒细胞集落刺激因子的疏水色谱复性研究。首先考察了甘油、吐温和聚乙二醇不同渗透质对粒细胞集落刺激因子稀释复性的影响，发现在稀释复性缓冲液中加入适当比例（15％）的甘油能够使蛋白回收率由25.4％提高到31.5％。利用双梯度疏水层析复性模式，建立了另一个包涵体蛋白质复性方法，即梯度增高甘油浓

论文目录

• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 蛋白质折叠复性研究的意义
• 1.1.1 蛋白质折叠状态与疾病
• 1.1.2 蛋白质折叠复性与蛋白质药物的设计和生产
• 1.1.3 生物工程走向产业化的需要
• 1.2 蛋白质折叠复性机理
• 1.2.1 蛋白质折叠复性的概念及其特点
• 1.2.2 变性蛋白质与天然蛋白质的结构特点
• 1.2.3 蛋白质折叠的复杂动力学
• 1.3 蛋白质体外折叠复性的主要影响因素
• 1.3.1 蛋白质的复性浓度
• 1.3.2 温度
• 1.3.3 pH值
• 1.3.4 离子强度
• 1.3.5 巯基氧化和二硫键形成
• 1.3.6 复性体系中变性剂的终浓度
• 1.3.7 变性蛋白质浓度
• 1.4 蛋白质体外折叠复性的方法
• 1.4.1 稀释
• 1.4.2 透析
• 1.4.3 超滤
• 1.4.4 反相胶团辅助复性
• 1.4.5 双水相系统复性
• 1.4.6 折叠促进剂和渗透质辅助复性
• 1.4.7 聚集抑制剂辅助复性
• 1.4.8 分子伴侣等蛋白质因子辅助复性
• 1.4.9 人工分子伴侣辅助复性
• 1.4.10 蛋白质工程促进复性
• 1.5 层析复性
• 1.5.1 非吸附层析:凝胶过滤层析复性
• 1.5.2 吸附层析之一:疏水层析复性
• 1.5.3 其他吸附层析复性
• 1.5.4 催化层析
• 1.6 蛋白质折叠复性的检测手段
• 1.6.1 生物学功能检测
• 1.6.2 光谱技术
• 1.6.3 层析技术
• 1.6.4 电泳技术
• 1.6.5 可溶性蛋白的测定
• 1.7 文献小结以及本文的立题思想与立题依据
• 2 复合干扰素的稀释复性研究
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 发酵生产C-IFN工程菌
• 2.3.2 C-IFN包涵体提取及变性蛋白制备
• 2.3.3 稀释复性方法
• 2.3.4 正交实验的设计
• 2.3.5 渗透质对复合干扰素稀释复性的影响
• 2.3.6 疏水色谱介质对复合干扰素稀释复性的影响
• 2.3.7 疏水色谱介质-渗透质混合体系对复合干扰素稀释复性的影响
• 2.3.8 C-IFN稀释复性不溶聚集体的再复性
• 2.3.9 复合干扰素的活性测定原理、VSV病毒扩增以及VSV病毒效价滴定
• 2.3.10 复合干扰素的活性测定步骤
• 2.3.11 蛋白浓度测定
• 2.4 实验结果及讨论
• 2.4.1 C-IFN工程菌的生产
• 2.4.2 C-IFN包涵体的制备
• 2.4.3 各因素对稀释复性的影响
• 2.4.4 蛋白质还原变性与非还原变性对稀释复性比活和复性蛋白回收率的影响
• 2.4.5 脉冲式稀释复性方法对复性效果的影响
• 2.4.6 稀释复性率与复性时间的关系
• 2.4.7 甘油和聚乙二醇分别对复合干扰素稀释复性的影响
• 2.4.8 蛋白质浓度对聚乙二醇辅助复合干扰素稀释复性的影响
• 2.4.9 不同疏水色谱介质对复合干扰素稀释复性的影响
• 2.4.10 聚乙二醇浓度在色谱介质-聚乙二醇混合体系辅助复性复合干扰素中的作用
• 2.4.11 不同稀释复性体系的比较
• 2.4.12 变性剂盐酸胍对不溶聚集体再复性的影响
• 2.4.13 聚集体复性与包涵体复性的比较
• 2.5 本章小结
• 3 稀释复性C-IFN各构象体判定及C-IFN的结构分析
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 反相高效液相层析分析
• 3.3.2 凝胶过滤层析分析
• 3.3.3 还原型与氧化型SDS-PAGE
• 3.3.4 离子交换层析分离纯化
• 3.3.5 扩大工艺后的离子交换层析分析
• 3.3.6 质谱分子量测定以及质谱二硫键定位测定
• 3.3.7 N-末端氨基酸序列测定
• 3.3.8 圆二色分析
• 3.3.9 荧光光谱分析
• 3.3.10 C-IFN生物活性测定
• 3.4 实验结果与讨论
• 3.4.1 稀释复性C-IFN的反相层析分析
• 3.4.2 稀释复性C-IFN的可溶聚集体分析
• 3.4.3 C-IFN二硫键测定以及稀释复性C-IFN错配体判定
• 3.4.4 复性C-IFN在反相层析中活性峰的判定
• 3.4.5 活性C-IFN的一级结构分析
• 3.4.6 活性C-IFN的圆二色波谱扫描和荧光光谱比较
• 3.4.7 C-IFN在离子交换层析分离纯化中的再变性
• 3.5 本章小结
• 4 复合干扰素的疏水相互作用色谱复性研究
• 4.1 前言
• 4.2 穿过式疏水相互作用色谱复性C-IFN研究
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.3 实验结果与讨论
• 4.3 吸附式疏水相互作用色谱复性C-IFN研究
• 4.3.1 实验材料
• 4.3.2 实验方法
• 4.3.3 实验结果与讨论
• 4.4 梯度洗脱结合吸附式疏水相互作用色谱复性C-IFN研究
• 4.4.1 实验材料
• 4.4.2 实验方法
• 4.4.3 实验结果与讨论
• 4.5 本章小结
• 5 粒细胞集落刺激因子的疏水层析复性研究
• 5.1 前言
• 5.2 实验材料
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 G-CSF包涵体变性蛋白的获得及其稀释复性
• 5.3.2 无梯度疏水作用层析复性
• 5.3.3 渗透质辅助无梯度疏水作用层析复性
• 5.3.4 盐酸胍单梯度疏水作用层析复性
• 5.3.5 渗透质辅助盐酸胍单梯度疏水作用层析复性
• 5.3.6 渗透质和盐酸胍双梯度疏水作用层析复性
• 5.3.7 G-CSF的反相高效液相层析分析
• 5.3.8 G-CSF的荧光光谱分析
• 5.3.9 G-CSF的生物活性测定
• 5.4 实验结果与讨论
• 5.4.1 稀释复性G-CSF
• 5.4.2 渗透质辅助稀释复性G-CSF
• 5.4.3 不同疏水介质对G-CSF复性的影响
• 5.4.4 渗透质辅助式洗脱对无梯度疏水层析复性G-CSF的影响
• 5.4.5 渗透质辅助式洗脱对盐酸胍梯度疏水层析复性G-CSF的影响
• 5.4.6 聚乙二醇与盐酸胍双梯度疏水层析复性 G-CSF
• 5.4.7 甘油与盐酸胍双梯度疏水作用层析复性 G-CSF
• 5.4.8 甘油浓度和甘油浓度梯度斜率对G-CSF复性效果的影响
• 5.4.9 梯度长度对G-CSF复性效果的影响
• 5.4.10 不同疏水层析方法复性G-CSF的荧光光谱分析
• 5.4.11 几种不同方法复性G-CSF的比较
• 5.5 本章小结
• 6 结论
• 6.1 本文工作的主要结果
• 6.2 本论文的主要创新之处
• 6.3 今后的工作展望
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表学术论文情况
• 致谢
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