小麦低分子量麦谷蛋白亚基分离及密码子使用特征分析

论文摘要

根据不同分子量蛋白质在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）迁移率不同,小麦（Triticum aestivum L.）麦谷蛋白亚基分为高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）和低分子量麦谷蛋白亚基（LMW-GS）。小麦HMW-GS和LMW-GS互作形成空间网格状结构决定小麦面包烘烤品质。然而小麦LMW-GS研究相对滞后。因此,获得我国独立的自主知识产权的LMW-GS功能基因,并用于改良我国小麦面包烘烤品质已迫在眉睫。该论文首先以国内优质强筋小麦中优9507为实验材料,通过优化SDS-PAGE技术蛋白质分离条件,分离小麦LMW-GS区段的特异条带,质谱鉴定获得肽段;进一步分析小麦麦谷蛋白亚基基因密码子使用特性,采用RT-PCR和RACE技术克隆目的基因核酸片段,建立小麦LMW-GS基因克隆技术体系。在此基础之上,以新疆本地主栽强筋小麦新春8为实验材料,锁定小麦面包烘烤品质主效LMW-GS,质谱鉴定获得肽段,为后续该小麦面包烘烤品质主效LMW-GS基因克隆、小麦HMW-GS和LMW-GS互作研究提供科学的数据参考。该论文主要研究结果如下:含0.3mol/LNaI和1.4%4-VP的LMW-GS提取液能有效提取小麦LMW-GS成分。在此基础上,当分离胶浓度为T=14%/C=3%、分离时间为40h、电极缓冲液为Tris-硼酸或Tris-甘氨酸时,能更加有效、准确、且重复性高地分离数目庞大的小麦LMW-GS。该技术体系为小麦LMW-GS深入研究的第一个限速步骤提供了良好的解决方案。从国内优质强筋小麦中优9507中锁定1个小麦面包烘烤品质可能相关的LMW-GS,命名为ZY9507-L1,其表观分子量为34kD。质谱鉴定获得5个肽段,分别命名为ZL1-1、ZL1-2、ZL1-3、ZL1-4、ZL1-5。其中,ZL1-1（肽段序列:GIIQPQQPAQLEVIR）与NCBI数据库中小麦已知LMW-GS氨基酸序列（GenBank登录号:ACJ76961.1）的覆盖率（Query coverage）为66%,ZL1-2（肽段序列:SVVHSIIMQQEQR）与小麦已知LMW-GS氨基酸序列（GenBank登录号:ABB04903.1）的Query coverage为92%。其余3个质谱鉴定获得的小肽段均与NCBI数据库中小麦已知LMW-GS氨基酸序列不存在相似性。为了解小麦麦谷蛋白亚基基因密码子使用特性,该文运用CodonW1.4.2和SPSS16.0软件对13个来源于小麦麦谷蛋白亚基基因的密码子用法特性进行了分析。结果显示,除1Dy10基因有效密码子数（ENC值）小于40外,其余亚基基因ENC值均介于40-50之间;密码子第三位GC含量（GC3）均在0.38-0.45之间;1Bx14基因偏向于使用A或T结尾的密码子,其余12个亚基基因偏向于使用G或C结尾的密码子;1Dy10与其余12个亚基基因间距离系数较大,然而各组染色体麦谷蛋白x-型或y-型亚基基因间距离系数较小。结果表明,小麦麦谷蛋白亚基基因具有较强的密码子使用偏爱性,各基因密码子用法上具有相似性,每一种氨基酸均存在1-2个偏爱密码子。在密码子用法差异上表现为,除1By9和1Dy10之外,无论是A染色体组、B染色体组,还是D染色体组,各组染色体上麦谷蛋白x-型或y-型亚基基因间密码子使用频率差异最小。这一分析结果对小麦HMW-GS功能基因资源的高效利用和LMW-GS新基因的克隆具有一定的指导意义。根据小麦面包烘烤品质相关LMW-GS ZY9507-L1质谱鉴定结果和小麦麦谷蛋白亚基基因密码子使用特性,该文以国内优质强筋小麦中优9507为实验材料,利用ZL1-1肽段设计3’端上游引物,采用RT-PCR和RACE技术获得目的基因ZL1-13’端序列。结果显示,分离获得2个不同的LMW-GS基因序列,分别命名为ZL1-1P和ZL1-1I,其中,ZL1-1P基因长度为620bp,可编码包含186个氨基酸残基的成熟蛋白质。该基因与NCBI数据库中许多小麦已知LMW-GS基因均具有同源性,其与小麦已知LMW-GS基因（登录号:FJ441109.1）的覆盖率为19%（见图5-11）;ZL1-1I基因长度为693bp,可编码包含209个氨基酸残基的成熟蛋白质。该基因与NCBI数据库中许多小麦已知LMW-GS基因均具有同源性,该基因序列与已知LMW-GS基因（登录号:FJ441109.1）的覆盖率为17%。初步证实上述2个基因可能均属于小麦LMW-GS基因的一部分,而且也证实了该小麦LMW-GS基因克隆技术体系是完全可行的。在上述已建立的基因克隆技术体系基础之上,根据面包烘烤品质的决定机制特征,从新疆本地主栽强筋小麦新春8中锁定1个小麦面包烘烤品质主效LMW-GS,命名为XC8-L1,其表观分子量为46kD。质谱鉴定获得215个肽段,分别命名为XL1-1、XL1-2、XL1-3、XL1-4、XL1-5、……、XL1-215。其中,XL1-1（肽段序列:AIIYSIVLQEQQQVR）、XL1-2（肽段序列:VNVPLYR）、XL1-3（肽段序列:TTTSVPFGVGTGVGAY）和XL1-4（肽段序列:LEVMTSIALR）与NCBI数据库中小麦已知LMW-GS氨基酸序列（GenBank登录号:ACZ59817.1 ）的Query coverage为100% , XL1-5 （肽段序列:TTTNVPFGVGTGVGSY）和XL1-6（肽段序列:VNVPLYR）与NCBI数据库中小麦已知LMW-GS氨基酸序列（GenBank登录号:ACA63873.1）的Query coverage为100%,XL1-7（肽段序列:QIAQLEVMTSIALR）和XL1-8（肽段序列:QIPEQSR）与NCBI数据库中小麦已知LMW-GS氨基酸序列（GenBank登录号:ADX68840.1）的Query coverage为100%,XL1-9（肽段序列:GTFLQPHQIAR）与NCBI数据库中小麦已知LMW-GS氨基酸序列（GenBank登录号:ADX68849.1）的Query coverage为100%。其余206个质谱鉴定后获得的小肽段均与NCBI数据库中小麦已知LMW-GS氨基酸序列不存在相似性。该论文不仅为小麦面包烘烤品质相关功能基因克隆提供技术体系,而且为获得我国独立的自主知识产权的小麦面包烘烤品质主效LMW-GS基因克隆提供有效的氨基酸序列支持,还为深入探讨小麦HMW-GS和LMW-GS互作研究、加快我国面包小麦改良步伐并实现优良面包粉的自主生产奠定一定的理论基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 小麦籽粒贮藏蛋白概述
• 1.2 小麦麦谷蛋白与面包烘烤品质的关系
• 1.2.1 小麦HMW-GS 组成和类型与小麦面包烘烤品质的关系
• 1.2.2 小麦LMW-GS 组成和类型与小麦面包烘烤品质的关系
• 1.3 小麦LMW-GS 概述
• 1.3.1 小麦LMW-GS 分类
• 1.3.2 小麦LMW-GS 基因的结构
• 1.3.3 小麦LMW-GS 基因的克隆
• 1.4 立题意义和研究内容
• 1.4.1 立题意义
• 1.4.2 研究内容
• 2 SDS-PAGE 有效分离小麦 LMW-GS 条件优化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料及背景
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.2.1 不同小麦LMW-GS 提取方法比较
• 2.1.2.2 SDS-PAGE 技术有效分离小麦LMW-GS 电泳分离最佳条件优化
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 小麦LMW-GS 样品提取液的优化
• 2.2.2 SDS-PAGE 分离小麦LMW-GS 最优分离胶浓度的确定
• 2.2.3 SDS-PAGE 分离小麦LMW-GS 最优分离时间的确定
• 2.2.4 SDS-PAGE 分离小麦LMW-GS 最优电泳缓冲液的选择
• 2.3 讨论
• 3 小麦面包烘烤品质相关 LMW-GS 区段蛋白分离及质谱鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料及背景
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.2.1 小麦面包烘烤品质相关LMW-GS 锁定原则
• 3.1.2.2 小麦LMW-GS 提取及浓度测定
• 3.1.2.3 小麦面包烘烤品质相关LMW-GS 分离及锁定
• 3.1.2.4 小麦面包烘烤品质相关LMW-GS 质谱鉴定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 小麦LMW-GS 提取液蛋白浓度测定
• 3.2.2 小麦面包烘烤品质相关LMW-GS 锁定
• 3.2.3 小麦面包烘烤品质相关LMW-GS ZY9507-L1 质谱鉴定
• 3.3 讨论
• 4 小麦麦谷蛋白亚基基因密码子使用特性分析
• 4.1 数据与分析方法
• 4.1.1 数据获取
• 4.1.2 分析方法
• 4.1.2.1 小麦麦谷蛋白亚基基因密码子使用特性分析
• 4.1.2.2 基于密码子使用偏好性的聚类
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 麦谷蛋白亚基基因同义密码子使用偏性分析
• 4.2.2 麦谷蛋白亚基基因同义密码子使用频率分析
• 4.2.3 不同麦谷蛋白亚基基因密码子使用频率的差异
• 4.3 讨论
• 5 小麦面包烘烤品质相关 LMW-GS 基因 ZL1-1 核酸片段获得
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验方法
• 5.1.2.1 小麦面包烘烤品质相关LMW-GS 基因ZL1-1 引物设计
• 5.1.2.2 总RNA 的提取、定量及完整性检查
• 5.1.2.3 小麦面包烘烤品质相关LMW-GS 基因ZL1-1 cDNA 第一链的合成
• 5.1.2.4 小麦面包烘烤品质相关LMW-GS 基因ZL1-1 3’RACE
• 5.1.2.5 PCR 产物回收与纯化
• 5.1.2.6 回收产物的TA 克隆
• 5.1.2.7 高效感受态细胞制备和转化
• 5.1.2.8 阳性克隆的筛选
• 5.1.2.9 小麦面包烘烤品质相关LMW-GS 基因ZL1-1 核酸片段测序
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 引物设计
• 5.2.2 总RNA 定量及完整性检查
• 5.2.3 小麦面包烘烤品质相关LMW-GS 基因ZL1-1 3’RACE 结果
• 5.2.4 菌落PCR 检测
• 5.2.5 小麦面包烘烤品质相关LMW-GS 基因ZL1-1 基因序列比较与分析.
• 5.3 讨论
• 6 小麦面包烘烤品质主效 LMW-GS 锁定及质谱鉴定
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 实验材料及背景
• 6.1.2 实验方法
• 6.1.2.1 目的亚基锁定原则
• 6.1.2.2 小麦LMW-GS 提取及浓度测定
• 6.1.2.3 小麦面包烘烤品质主效LMW-GS 分离及锁定
• 6.1.2.4 小麦面包烘烤品质主效LMW-GS 质谱鉴定
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 小麦LMW-GS 提取液蛋白浓度测定
• 6.2.2 小麦面包烘烤品质主效LMW-GS 锁定
• 6.2.3 小麦面包烘烤品质主效LMW-GS XC8-L1 质谱鉴定
• 6.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 在读期间发表的论文
• 后记