溶瘤型1型单纯疱疹病毒的研究

论文摘要

1型单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus type 1,HSV-1）具天然的嗜神经性和高效的感染能力,已广泛应用于肿瘤治疗研究和临床实验。目前开发的溶瘤HSV-1包括扩增子（Amplicon）、复制缺陷型病毒（Replication-defective virus）和条件选择性复制病毒（Conditional-replicative virus）三类。前两类HSV-1在细胞中不能复制,溶瘤效应限于局部组织,而复制型溶瘤HSV-1能够在肿瘤细胞中复制,复制周期完成后可裂解肿瘤细胞并释放子代病毒,继而感染临近的肿瘤细胞。目前,一些复制型溶瘤HSV-1已进入临床试验阶段,并在肿瘤治疗方面取得了一些令人鼓舞的结果。前期研究已获得了删除HSV-1内部反向重复序列的重组病毒HSV-1/BN。本研究分别将报告基因荧光素酶（Luciferase）和绿色荧光蛋白（EGFP,enhanced green fluorescent protein）构建至穿梭质粒pKO5/BN,获得携带荧光素酶基因的穿梭质粒pKO5/LUC和携带绿色荧光蛋白基因的穿梭质粒pKO5/EGFP,经多种限制性酶切鉴定穿梭质粒,均得到与预计相符的条带,说明穿梭质粒构建正确。以穿梭质粒电激转化含有HSV-1细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome,BAC-HSV）的大肠杆菌,通过抗生素抗性和生化筛选获得发生同源重组的重组菌株。经菌落PCR鉴定和Southern blotting检测,均得到与预计相符的条带,说明重组DNA是正确的。重组DNA转染Vero细胞后挑取发生明显细胞病理变化（cell pathological changes,CPE）的噬斑,超声释放病毒后再次感染Vero细胞以纯化和富集重组病毒。PCR和Southern检测重组病毒DNA,均得到与预计大小相符的条带,证明获得的重组病毒是正确的,分别命名为HSV/BN/LUC和HSV/BN/GFP。经检测重组病毒的滴度可达1.53×108pfu/mL。野生型HSV-1、HSV/BN/LUC和HSV/BN/GFP分别感染Vero细胞,结果表明野生型HSV-1和重组病毒在Vero细胞中的复制能力相似。HSV/BN/LUC感染Vero细胞后检测荧光素酶基因的表达水平,结果表明荧光素酶伴随病毒的复制而表达。以上结果说明删除HSV-1内部反向重复序列不会影响病毒的复制,该区域可以作为外源基因插入的位点。1型单纯疱疹病毒潜伏相关转录体启动子（Latency associated transcriptspromoter,LATP）在病毒于神经组织中潜伏感染期间保持活性。本研究利用PCR技术扩增获得HSV-1的LATP,并将LATP分别插入绿色荧光蛋白基因和荧光素酶基因前,获得真核表达质粒pcDNA/LATP/EGFP和pGL3/LATP/LUC。pcDNA/LATP/EGFP转染293T细胞后,检测到绿色荧光蛋白基因的表达,说明LATP具有启动子活性,其活性活性低于PCMV;继而以pcDNA/LATP/EGFP和pGL3/LATP/LUC分别转染HeLa细胞和神经胶质瘤细胞SK-N-SH,结果表明绿色荧光蛋白基因和荧光素酶基因在SK-N-SH细胞中的表达显著高于其在HeLa细胞中的表达水平,说明LATP具有神经组织特异性,可作为神经组织特异性表达元件。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略语
• 第一部分 文献综述 复制型溶瘤HSV-1
• 1. 复制型溶瘤HSV-1 的主要类型
• 1.1 删除HSV-1 核苷酸代谢酶编码基因
• 1.2 删除HSV-1 神经毒基因γ34.5
• 1.3 删除HSV-1 内部反向重复序列
• 2. 复制型溶瘤HSV-1 与放化疗结合治疗肿瘤
• 2.1 复制型溶瘤HSV-1 与化疗相结合治疗肿瘤
• 2.2 溶瘤载体与放疗相结合治疗肿瘤
• 参考文献
• 第二部分 研究部分
• 第一章 溶瘤型1 型单纯疱疹病毒的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种和质粒
• 1.2 细胞系
• 1.3 主要试剂及培养基
• 1.4 引物设计与合成
• 1.5 重组质粒的构建
• 1.6 同源重组及重组子的筛选
• 1.7 细胞培养
• 1.8 病毒纯化与鉴定
• 1.9 Southern Blotting
• 1.10 重组病毒的滴度检测与生长曲线
• 2 结果
• 2.1 穿梭质粒的构建
• 2.2 同源重组
• 2.3 重组DNA 转染细胞
• 2.4 重组病毒在正常胞系中的生长曲线
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二章 HSV-1潜伏相关启动子驱动报告基因在神经细胞中表达
• 1. 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2. 结果
• 2.1 含LATP 的重组质粒的构建
• 2.2 报告基因在Hela 细胞和SK-N-SH 细胞中表达水平的差异性分析
• 3. 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历