论文摘要
背景与目的放射-基因治疗即同时将具有肿瘤杀伤和辐射诱导特性的基因转入人体细胞内,对肿瘤局部实施照射时诱导肿瘤杀伤基因的表达,造成射线和基因对肿瘤的双重杀伤作用。大量文献报道,Egr-1在照射后可使其下游基因表达迅速增加,其启动子是一种辐射敏感性调控序列cArGs。p53反应元件（pREs）是p53蛋白上调下游基因表达的增强子序列。然而,在常规分割剂量下,辐射敏感性序列诱导的治疗性基因表达强度低且持续时间短,治疗效果不理想。正反馈是基因环路中的一种重要模式,系指由特定基因与目的基因相互作用,构成对目的基因表达放大调控的基因亚网络。本研究将正反馈基因环路引入放射-基因治疗,即将放射敏感性反应元件（cArGs）与p53反应元件（pREs）和p53基因串联构成的正反馈基因环路相耦联,构建放射控导的野生型p53蛋白正反馈基因环路,分析该环路在体外环境的动力学特征及放大效应。进一步利用该基因环路在时间、空间上调控wt-p53基因的表达,研究其在裸鼠体内的抗肿瘤效应,旨在探索既可相对降低等照射剂量,缓解正常组织损伤,又可实现肿瘤放射局部野生型p53基因持续性定位表达,诱导肺癌细胞凋亡的肺癌治疗新途径。研究方法1.构建基因环路表达载体及对照组载体将全基因合成的放射敏感性增强子（E6）、p53反应元件（R4）、以及二者的耦联物（E6R4）,分别取代PCI-neo真核表达载体的CMV增强子,但保留核心启动子TATA盒;采用PCR技术,以pcDNA3.1（+）-p53-EGFP质粒为模板,扩增wt-p53 cDNA全长序列;双酶切从双顺反子表达质粒pIRES2-EGFP中获得IRES2-EGFP片段。将上述片段依次克隆于PCI-neo载体相应的多克隆位点,分别构建pE6-p53-EGFP、pR4-p53-EGFP、pE6R4-p53-EGFP表达载体。酶切、测序鉴定目的片段正确性。2.体外分析放射控导的wt-p53蛋白正反馈基因环路动力学特征将上述3个重组子和pcDNA3.1（+）-p53-EGFP质粒稳定转染肺腺癌细胞株H1299（p53-/-）,以H1299（p53-/-）为对照,用RT-PCR方法分别检测各组细胞wt-p53基因与细胞基因组整合情况。1) wt-p53蛋白正反馈基因环路的鉴定采用免疫组化法获得Ad5CMV-p53感染H1299（p53-/-）细胞最佳感染复数;以最佳感染复数（MOI=40）感染pR4-p53-EGFP/H1299细胞（V+P组）,设质粒组（P组）和单纯病毒感染组（V组）为对照组,Western-blot方法鉴定不同时相点各组细胞wt-p53蛋白表达情况。2) cArGs放射敏感性的鉴定Western-blot方法检测pE6-p53-EGFP/H1299细胞在不同放射剂量及同一放射剂量不同时相点wt-p53蛋白表达量和持续时间。3)放射控导的wt-p53蛋白正反馈基因环路动力学特征检测倒置荧光显微镜及流式细胞仪分析不同放射剂量的EGFP分布情况;Western-blot检测pE6R4-p53-EGFP/H1299细胞在不同放射剂量和同一放射剂量不同时相点的wt-p53蛋白表达量和持续时间。3.体外分析放射控导的wt-p53蛋白正反馈基因环路的抗癌生物学效应给予治疗组pE6R4-p53-EGFP/H1299细胞和对照组pcDNA3.1（+）-p53-EGFP/H1299细胞、pE6-p53-EGFP/H1299细胞、pR4-p53-EGFP/H1299和H1299（p53-/-）细胞4 Gy 8MV X线照射,分析该环路在放射线诱导下对肺腺癌细胞周期和细胞凋亡率的影响;绘制细胞放射剂量-存活曲线,计算D0值及放射增敏比。4.分析放射控导的wt-p53蛋白正反馈基因环路对肺腺癌细胞裸鼠移植瘤模型生物学行为的影响将治疗组pE6R4-p53-EGFP/H1299细胞和对照组pE6-p53-EGFP/H1299、pR4-p53-EGFP/H1299、H1299（p53-/-）细胞分别注射于裸鼠背部皮下,建立裸鼠移植瘤模型;分别给予射线照射,记录治疗开始后肿瘤体积的变化,绘制肿瘤生长曲线;称取瘤重,计算抑瘤率;HE染色观察瘤组织形态结构;免疫组化法检测瘤组织wt-p53表达;将治疗组细胞和对照组细胞成瘤裸鼠,分别给予不同剂量的X线照射,观察照射后肿瘤体积变化,分析计算TCD50及SER。研究结果1.成功构建重组质粒构建了治疗载体pE6R4-p53-EGFP和对照载体pE6-p53-EGFP、pR4-53-EGFP表达载体,酶切和测序鉴定所克隆片段正确。2.阐明了放射控导的wt-p53蛋白正反馈基因环路动力学特征RT-PCR方法从4组稳定转染重组质粒的细胞内均扩增出wt-p53基因,说明该基因在转染的细胞中稳定表达。免疫组化法确定Ad5CMV-p53 MOI=40为最佳感染复数。Western-blot分析质粒组（p组）wt-p53蛋白表达随着时相延长无明显差异（p>0.05）,病毒组（V组）和病毒感染的质粒组（V+P组） wt-p53蛋白均在感染后72h达高峰,随着时间延长,二者均下降,但后者下降缓慢;3周时,（V+P组）组分别为P组和V组的2.15倍和6.25倍,证明正反馈环路成立。分别用不同剂量照射治疗组pE6R4-p53-EGFP/H1299细胞和对照组pE6-p53-EGFP/H1299细胞,0～4Gy,wt-p53蛋白表达呈增高趋势,4Gy照射时,wt-p53蛋白表达量最高,治疗组是对照组的1.42倍。6Gy照射时,蛋白量均显著下降,治疗组是对照组1.58倍,与该剂量射线对细胞损伤较重相关。4Gy照射后3h,两组细胞wt-p53蛋白均开始升高,12h达高峰,但治疗组是对照组的1.651倍,对照组在36h蛋白基本恢复假照射水平,而治疗组在144h时其蛋白表达量是假照射水平的1.86倍。FCM分析在照射后12h和144h,治疗组pE6R4-p53-EGFP/H1299细胞EGFP荧光强度分别是对照组细胞pCMV-p53-EGFP荧光强度的3.95倍和2.5倍,说明wt-p53蛋白正反馈基因环路在放射控导下可使wt-p53蛋白表达量显著增高。3.体外证实放射控导的wt-p53蛋白正反馈基因环路策略有显著的抗癌生物学行为有显著影响4Gy X线照射治疗组和对照组细胞后12h,FCM分析治疗组在照射后发生明显G0/G1期阻滞（75.13±1.42）%。照射后各组细胞凋亡率均高于照射前组,照射后治疗组细胞凋亡率（23.73±0.21%）分别是对照组4组细胞的5.69倍（4.17±0.12）%、1.91倍（12.40±0.20） %、1.51倍（15.67±0.32） %和2.57倍（9.23±0.15） %。分析计算pE6R4-p53-EGFP/ H1299、pE6-p53-EGFP/H1299和H1299（p53-/-）三组细胞D0值分别0.91Gy、1.073 Gy和1.413 Gy,根据D0值计算SER分别为2.63和1.34,说明放射可诱导wt-p53正反馈基因基因环路,上调wt-p53蛋白表达,调控细胞周期和诱导细胞凋亡,该基因环路可增加肺腺癌细胞放射敏感性。4.体内证实放射控导的wt-p53蛋白正反馈基因环路策略对肺腺癌细胞裸鼠移植瘤模型生物学行为的影响免疫组化结果显示移植瘤组织中wt-p53蛋白表达定位于细胞核内,pE6R4-p53- EGFP/H1299治疗组wt-p53蛋白表达量（64.8%）显著高于对照组pR4-p53-EGFP/H1299组（4.2%）、pE6-p53-EGFP/H1299组（22.1%）和H1299（p53-/-）组,其中H1299（p53-/-）组无表达。移植瘤生长曲线表明,pE6R4-p53-EGFP/H1299+IR组移植瘤的生长明显受到抑制,抑瘤率（86.41%）明显高于对照组pE6-p53-EGFP/H1299+IR组（70.76%）、pR4- p53-EGFP/H1299+IR组（35.53%）和H1299+IR组（12.58%）。分析计算pE6R4-p53- EGFP/H1299治疗组、pE6-p53-EGFP/H1299和H1299（p53-/-）对照组的荷瘤鼠TCD50分别为12.1 Gy、15.2 Gy和19.4 Gy。根据TCD50计算pE6R4-p53-EGFP/H1299治疗组和pE6-p53-EGFP/H1299组SER分别为1.6和1.28,说明治疗载体组的肿瘤组织对放射最敏感,放射控导的wt-p53蛋白正反馈基因环路明显增加了瘤组织对放射的敏感性。研究结论成功构建了放射控导的wt-p53蛋白正反馈基因环路,该基因环路不仅使目的基因的表达水平提高,而且使目的基因在转染细胞内的表达逐步放大和持续表达,较好地解决了目前放射-基因治疗中所遇到的基因表达水平低且短暂的问题。由于基因环路可明显增强细胞中wt-p53蛋白的表达水平,因此能够有效使肿瘤细胞停滞于G1期,诱导细胞凋亡,提高肺癌细胞对放射的敏感性。裸鼠体内移植瘤模型实验进一步证实了这种正反馈基因环路在放射线作用下对肿瘤的杀伤效果。因此,我们的实验结果不仅完善了放射-基因治疗这一新的肿瘤治疗模式,而且对其它基因治疗模式也有一定的借鉴作用。
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