首页> 正文

重组人脑钠肽（rhBNP）新药物分子的设计、制备及生物活性分析

2020-12-07阅读(112)

重组人脑钠肽（rhBNP）新药物分子的设计、制备及生物活性分析

论文摘要

人脑钠肽（hBNP）是心力衰竭时人体分泌的作为代偿功能的一种内源性多肽。hBNP与其特异性钠尿肽受体结合,引起细胞内cGMP水平升高和平滑肌舒张,改善患者的症状。hBNP的药用价值已被肯定,但因其稳定性差、生物利用度低,体内半衰期仅为18 min,提示需以hBNP为药物前体,设计其成药分子,促进hBNP分子的药物化。本论文采用人血清白蛋白（HSA）融合技术设计了4种重组人脑钠肽（rhBNP）新药物分子--HSA融合rhBNP（rhBNP-HSA）,并对其制备方法进行了研究。主要研究结果如下:针对hBNP分子量小,易被肾脏排泄、成药性差的缺陷,设计了4种HSA融合rhBNP新药物分子。通过基因重组技术,构建了4种新药物分子的融合基因,分别为hsa-（bnp）2、bnp-hsa、（bnp）2-hsa和（bnp）4-hsa,并插入到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K,获得了融合蛋白重组表达质粒。电击转化毕赤酵母GS115,筛选获得高表达融合蛋白菌株（GS115/pPIC9K -hsa-（bnp）2,156 mg/l;GS115/pPIC9K-bnp-hsa,212 mg/l;GS115/pPIC9K-（bnp）2-hsa,161 mg/l;GS115/pPIC9K-（bnp）4-hsa,47 mg/l）。摇瓶发酵的优化条件研究确定发酵步骤为:菌株接种于YPD培养基,30°C,200 r/min培养28 h,静置沉降,菌体沉淀复溶于含2%甲醇的BMMY培养基,体积浓缩1.5倍,30°C,200 r/min摇床诱导培养,每24 h补加2%甲醇,诱导72h后收获目的蛋白。建立了融合蛋白分离纯化的技术路线:发酵液离心后用截留分子量为10 kDa的biomax超滤膜浓缩20倍,Blue Sepharose亲和层析聚集HSA融合分子,产品纯度达到治疗性生物制品的要求（纯度≥95%）,蛋白回收率≥56%。建立了rhBNP细胞活性分析法,通过定量分析小鼠单核/巨噬细胞Raw264.7中iNOS和TNFαmRNA水平的抑制强度,来判断rhBNP活性高低,发现HSA-（BNP）2有较高的生物活性。体内降压实验也证明HSA-（BNP）2有一定的降压作用。建立了超微量检测融合蛋白HSA-（BNP）2完整分子的双抗夹心ELISA方法,其检测范围在0.625200μg/ml之间。初步应用于啮齿类小鼠药代动力学rhBNP融合蛋白HSA-（BNP）2血药浓度分析,其血浆半衰期为2.14 h,与BNP单体在小鼠血浆中的半衰期3.1 min相比,融合蛋白的血浆半衰期延长了40倍。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 绪论
  • 1.1 概述
  • 1.2 钠尿肽家族研究进展
  • 1.2.1 钠尿肽家族（natriuretic peptides, NPs）成员
  • 1.2.2 钠尿肽受体（natriuretic peptide receptor, NPR）
  • 1.3 BNP 研究进展
  • 1.3.1 BNP 的生理功能
  • 1.3.2 BNP 的临床应用
  • 1.3.3 rhBNP 药物目前存在的问题与解决措施
  • 1.3.4 人血清白蛋白（HSA）融合技术研究进展
  • 1.4 立题背景及研究内容
  • 第二章 RHBNP 新药物分子设计与其表达载体的构建
  • 2.1 材料
  • 2.1.1 菌种和质粒
  • 2.1.2 培养基
  • 2.1.3 工具酶
  • 2.1.4 试剂
  • 2.1.5 主要仪器
  • 2.1.6 引物
  • 2 基因的优化与合成'>2.1.7 （bnp）2基因的优化与合成
  • 2.2 方法
  • 2.2.1 重组质粒pMD19T-hsa 的构建
  • 2 的拼接'>2.2.2 融合基因hsa-（bnp）2的拼接
  • 2.2.3 融合基因bnp-hsa 的拼接
  • 2-hsa 的拼接'>2.2.4 融合基因（bnp）2-hsa 的拼接
  • 4-hsa 的拼接'>2.2.5 融合基因（bnp）4-hsa 的拼接
  • 2.2.6 融合基因与表达载体pPIC9K 的连接
  • 2.3 结果与讨论
  • 2.3.1 融合基因hsa-（bnp）2、bnp-hsa、（bnp）2-hsa 和（bnp）4-hsa 的构建原理
  • 2.3.2 PCR 扩增hsa 和bnp 目的基因
  • 2、pPIC9K-bnp-hsa、pPIC9K-（bnp）2-hsa 和pPIC9K-（bnp）4-hsa'>2.3.3 构建表达载体pPIC9K-hsa-（bnp）2、pPIC9K-bnp-hsa、pPIC9K-（bnp）2-hsa 和pPIC9K-（bnp）4-hsa
  • 2.4 本章小结
  • 第三章 RHBNP 新药物分子制备的摇瓶发酵条件研究
  • 3.1 材料
  • 3.1.1 菌种
  • 3.1.2 培养基
  • 3.1.3 试剂
  • 3.1.4 主要仪器
  • 3.2 方法
  • 3.2.1 线性化表达载体的制备
  • 3.2.2 毕赤酵母GS115 感受态细胞的制备
  • 3.2.3 毕赤酵母GS115 感受态细胞的转化
  • 3.2.4 融合蛋白的诱导表达
  • 3.2.5 发酵液中融合蛋白的western blot 鉴定
  • 3.2.6 毕赤酵母工程菌生长曲线的测定
  • 3.2.7 甲醇浓度和诱导时间对融合蛋白表达的影响
  • 3.2.8 扩大培养时不同浓缩倍数对融合蛋白表达的影响
  • 3.3 结果与讨论
  • 3.3.1 融合蛋白的诱导表达及高产菌株的筛选
  • 3.3.2 发酵液中融合蛋白的western blot 鉴定
  • 3.3.3 生长曲线测定
  • 3.3.4 甲醇浓度和诱导时间对融合蛋白表达的影响
  • 3.3.5 扩大培养时不同浓缩倍数对融合蛋白表达的影响
  • 3.4 本章小结
  • 第四章 RHBNP 新药物分子的分离纯化研究
  • 4.1 材料
  • 4.1.1 菌种
  • 4.1.2 培养基及溶液配制
  • 4.1.3 试剂
  • 4.1.4 主要仪器
  • 4.2 方法
  • 4.2.1 毕赤酵母工程菌在7.5 l 发酵罐中的高密度发酵实验
  • 4.2.2 发酵液的超滤浓缩
  • 2 发酵液的初步分离纯化'>4.2.3 HSA-（BNP）2发酵液的初步分离纯化
  • 2-HSA 和（BNP）4-HSA 发酵液的初步分离纯化'>4.2.4 BNP-HSA、（BNP）2-HSA 和（BNP）4-HSA 发酵液的初步分离纯化
  • 4.2.5 融合蛋白的精细纯化
  • 4.2.6 HPLC 检测融合蛋白纯度
  • 4.3 结果与讨论
  • 4.3.1 毕赤酵母工程菌在发酵罐中的高密度发酵实验
  • 4.3.2 发酵液的超滤浓缩
  • 2 发酵液的初步分离纯化'>4.3.3 HSA-（BNP）2发酵液的初步分离纯化
  • 2-HSA 和（BNP）4-HSA 发酵液的初步分离纯化'>4.3.4 BNP-HSA、（BNP）2-HSA 和（BNP）4-HSA 发酵液的初步分离纯化
  • 4.3.5 融合蛋白的精细纯化
  • 4.3.6 HPLC 检测融合蛋白纯度
  • 4.4 本章小结
  • 第五章 RHBNP 新药物分子的活性分析
  • 5.1 材料
  • 5.1.1 细胞株与样品
  • 5.1.2 培养基与试剂
  • 5.1.3 主要溶液配制
  • 5.1.4 实验动物
  • 5.1.5 主要仪器
  • 5.2 方法
  • 5.2.1 rhBNP 细胞活性分析
  • 5.2.2 大鼠体内降压活性实验
  • 5.3 结果与讨论
  • 5.3.1 rhBNP 细胞活性分析
  • 5.3.2 融合蛋白体内活性验证
  • 5.4 本章小结
  • 第六章 RHBNP 新药物分子定量分析及其初步应用
  • 6.1 材料
  • 6.1.1 主要试剂
  • 6.1.2 主要仪器
  • 6.1.3 实验动物
  • 6.1.4 主要溶液配方
  • 6.2 方法
  • 2 标准品浓度系列准备'>6.2.1 融合蛋白HSA-（BNP）2标准品浓度系列准备
  • 6.2.2 双抗夹心ELISA 基本操作步骤
  • 6.2.3 捕获抗体和检测抗体最佳稀释倍数的确定
  • 6.2.4 标准曲线的绘制
  • 6.2.5 方法学评价
  • 6.2.6 小鼠初步药代动力学分析
  • 6.3 结果
  • 6.3.1 捕获抗体和检测抗体最佳稀释倍数的确定
  • 6.3.2 标准曲线绘制
  • 6.3.3 方法学评价
  • 6.3.4 小鼠初步药代动力学分析
  • 6.4 讨论
  • 6.5 本章小结
  • 结论与展望
  • 创新点
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录Ⅰ：作者在攻读博士学位期间发表的论文
  • 附录Ⅱ：融合基因DNA 序列

    • 相关论文文献

    • [1].rhBNP对急性失代偿性心力衰竭的治疗效果分析[J]. 河南医学研究 2017(03)
    • [2].左西孟旦联合rhBNP对急性失代偿性心力衰竭患者心功能的影响[J]. 海南医学 2020(19)
    • [3].rhBNP治疗难治性心力衰竭的临床观察[J]. 中国卫生产业 2013(35)
    • [4].rhBNP治疗急性心肌梗塞伴急性左心衰的临床疗效[J]. 中国医药导刊 2013(12)
    • [5].参附注射液联合rhBNP治疗急性心力衰竭的临床观察[J]. 中西医结合心脑血管病杂志 2017(14)
    • [6].rhBNP与硝普钠对顽固性心力衰竭的疗效比较[J]. 热带医学杂志 2016(01)
    • [7].rhBNP联合左西孟坦治疗急性失偿性老年心力衰竭的应用效果观察[J]. 现代诊断与治疗 2020(02)
    • [8].rhBNP在缺血性心脏病心力衰竭治疗中的临床观察[J]. 哈尔滨医科大学学报 2016(05)
    • [9].静脉应用rhBNP对急性前壁心肌梗死合并糖尿病患者肾功能的影响[J]. 河北医科大学学报 2020(08)
    • [10].rhBNP对心力衰竭合并肾功能不全的临床疗效观察[J]. 现代生物医学进展 2013(25)
    • [11].rhBNP对急性心肌梗死早期高危患者心功能及左室重塑的影响[J]. 中国循证心血管医学杂志 2015(02)
    • [12].rhBNP对重症心脏瓣膜病术后血流动力学效应的影响[J]. 西南国防医药 2013(08)
    • [13].rhBNP对内毒素介导的犬急性肾损伤的保护作用[J]. 中国生化药物杂志 2014(03)
    • [14].术前负荷剂量rhBNP对急性前壁心肌梗死行急诊经皮冠状动脉介入时冠脉无复流的干预作用[J]. 武警医学 2017(05)
    • [15].rhBNP对急性前壁心肌梗死合并心力衰竭患者左心功能及远期左心室重构的影响[J]. 河北医药 2013(16)
    • [16].评价重组人脑利钠肽(rhBNP)治疗老年急性心肌梗死并心力衰竭的疗效[J]. 中国医药指南 2018(06)
    • [17].rhBNP治疗急性心肌梗塞伴急性左心衰的临床疗效[J]. 求医问药(下半月) 2012(11)
    • [18].rhBNP联合美托洛尔治疗慢性心力衰竭疗效观察及对BNP和心功能的影响[J]. 慢性病学杂志 2018(02)
    • [19].rhBNP联合硝普钠治疗难治性心衰的临床观察[J]. 临床医学研究与实践 2017(10)
    • [20].rhBNP在心力衰竭合并肾功能不全中的应用前景[J]. 现代生物医学进展 2015(06)
    • [21].rhBNP联合左西孟旦治疗急性心肌梗死合并心力衰竭的疗效及安全性评价[J]. 中国现代药物应用 2016(20)
    • [22].rhBNP不同给药方式对慢性心衰急性失代偿性重症患者的临床疗效[J]. 内蒙古医学杂志 2020(07)
    • [23].心功能Ⅱ～Ⅲ级急性前壁心肌梗死患者PCI术后应用rhBNP的临床价值分析[J]. 检验医学与临床 2018(02)
    • [24].重组人脑利钠肽治疗心力衰竭的研究进展[J]. 实用药物与临床 2009(04)
    • [25].rhBNP联合左西孟坦治疗心肌梗死伴心力衰竭临床疗效的Meta分析[J]. 海南医学 2020(06)
    • [26].rhBNP对慢性心力衰竭患者血清NT-proBNP及IL-6水平的影响[J]. 热带医学杂志 2016(07)
    • [27].rhBNP在非PCI急性心肌梗死的应用的短期观察[J]. 世界最新医学信息文摘 2016(12)
    • [28].rhBNP在老年顽固性心衰患者中的应用[J]. 临床心电学杂志 2020(02)
    • [29].阿托伐他汀联合rhBNP治疗AMI合并心力衰竭的临床疗效[J]. 检验医学与临床 2017(19)
    • [30].rhBNP通过抑制细胞凋亡减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤[J]. 基因组学与应用生物学 2020(03)

    标签：;  ;  ;  ;  ;  ;  

    重组人脑钠肽（rhBNP）新药物分子的设计、制备及生物活性分析
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2024 毕速过 版权所有 鄂ICP备12018319号-5