脊椎动物激肽原基因的系统发育分析

论文摘要

激肽原是缓激肽的前体,在不同种类的动物中,它们的结构和功能都存在着非常大的差异。在哺乳动物和两栖动物之间,这种差异更加明显。甚至连最保守的缓激肽结构域的合成模式和结构都存在差异。除共有的缓激肽结构域之外,哺乳动物激肽原还具有三个半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域（N末端的一个不含常规的半胱氨酸蛋白酶结合位点,另外两个含常规的半胱氨酸蛋白酶结合位点）。为了更进一步阐明激肽原基因的进化机制,在这篇论文中,利用公共数据库中的EST和基因组数据已识别出19个新的激肽原氨基酸序列（包括哺乳动物、鸟类和鱼类）,加上之前经实验证实的激肽原,共收集到了57个激肽原氨基酸序列,同时结合氨基酸序列和基因结构作为分子标记,详细地研究了脊椎动物激肽原基因的系统发育关系。主要的研究结果如下:1)基于邻接法构建的氨基酸序列进化树表明,所有的激肽原被分为两簇,一簇包括哺乳动物、鸟类和鱼类,另一簇仅包括两栖动物。较高的自展验证值支持了该进化树拓扑结构的准确性及预测的激肽原序列的可靠性。2)在这57个激肽原序列中有来自于16个物种的24个激肽原具有明确的内含子-外显子边界,它们被用来进行基因结构的分析。结果表明大部分内含子的位置和相位是保守的,但一些内含子仅存在于哺乳动物和鸟类中,而另一些内含子仅存在于鱼类中。3)对这57个激肽原氨基酸序列除去信号肽之后进行结构保守性的分析,结果表明除缓激肽结构域保守的存在于所有物种中之外,其它一些结构域的存在则具有种属特异性。4)对两栖动物缓激肽结构域的进一步分析还发现,两栖动物皮肤分泌物对于特异捕食者的防御机制是缓激肽受体依赖的。5)为了更清晰地揭示脊椎动物激肽原基因的进化,在这个研究中,从现存最古老的无颌类脊椎动物七鳃鳗（Lampetra japonica）肝脏中克隆出了激肽原基因,其开放阅读框含546个核苷酸,编码181个氨基酸残基。对氨基酸序列的分析表明,其具有一个无常规半胱氨酸蛋白酶结合位点的半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域和一个氨基酸残基发生了部分替换的缓激肽结构域。6)利用RT-PCR技术,检测出除了肝脏外,激肽原也在七鳃鳗的肠、肾和白细胞等组织中表达,但不存在于口腔腺中。综合上述的研究结果得出:在现存最原始的脊椎动物七鳃鳗中,激肽原基因编码一个缓激肽结构域和一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域。随着物种的进化,该基因逐步加入了其它一些序列,其所编码的蛋白质也逐渐多功能化。特别地是,在两栖动物中,激肽原基因特化出一种仅编码单一缓激肽结构域的类型,其在不种的两栖动物中频繁地发生着多倍化,而非特化的常规类型的激肽原基因则成为假基因,并且在序列上发生了极大的退化,但其基因结构仍然保守。本文的结果为更深入地揭示激肽原以及其它基因家族的进化机制提供了理论基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 激肽原基因的研究进展
• 1.1 哺乳动物激肽原基因研究进展
• 1.1.1 哺乳动物激肽原基因结构
• 1.1.2 人体内激肽原的功能
• 1.2 非哺乳动物激肽原基因研究进展
• 1.3 小结
• 第二章 脊椎动物激肽原基因的系统发育分析
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 激肽原的识别
• 2.2.2 序列比对和系统发育分析
• 2.2.3 基因结构分析
• 2.2.4 信号肽预测和基序分析
• 2.2.5 两栖动物缓激肽结构域的变化位点分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 激肽原家族新成员的识别
• 2.3.2 脊椎动物激肽原的系统发育分析
• 2.3.3 相对于氨基酸序列比对的基因结构
• 2.3.4 激肽原的保守性
• 2.3.5 两栖动物缓激肽的结构多样性
• 2.4 讨论
• 2.4.1 不同数据库中序列的差异
• 2.4.2 激肽原的系统发育关系
• 2.4.3 激肽原基因内含子位置和相位的进化趋势
• 2.4.4 激肽原结构域的进化
• 2.4.5 两栖动物缓激肽的多样性
• 2.5 结论
• 第三章 日本七鳃鳗肝脏组织中激肽原基因的克隆与分析
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 总RNA 的提取
• 3.2.3 已知序列验证
• 3.2.4 cDNA3’末端快速扩增反应（3’RACE）
• 3.2.5 cDNA5’末端快速扩增反应（5’RACE）
• 3.2.6 序列拼接及最终验证
• 3.2.7 三极结构预测
• 3.2.8 序列比对和系统发育分析
• 3.2.9 组织分布分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 七鳃鳗肝脏总RNA 的提取
• 3.3.2 七鳃鳗肝脏激肽原的扩增及蛋白结构域预测
• 3.3.3 系统发育分析
• 3.3.4 组织分布
• 3.4 讨论
• 3.4.1 3’非翻译区的可变性
• lamprey 结构域的特点'>3.4.2 kng_lamprey 结构域的特点
• 3.4.3 七鳃鳗激肽原的组织分布特点
• 3.5 结论
• 第四章 全文总结
• 参考文献
• 附录
• 附录1 激肽原基因的相关信息
• 附录2 FASTA 格式的激肽原氨基酸序列
• 附录3 SignalP 3.0 在线软件预测的激肽原信号肽序列
• 附录4 运用MEME 在线软件，在所有激肽原氨基酸序列（无信号肽序列）中发现的保守基序的类型和分布
• 附录5 运用MEME 在线软件，在所有激肽原氨基酸序列（无信号肽序列）中发现的保守基序
• 附录6 运用MEME 在线软件，在两栖动物激肽原氨基酸序列（无信号肽序列）中发现的保守基序的类型和分布
• 附录7 运用MEME 在线软件，在两栖动物激肽原氨基酸序列（无信号肽序列）中发现的保守基序
• 附录8 用作可变位点分析的两栖动物缓激肽
• 附录9 3’RACE 测得的4 个克隆子的序列比对
• 发表论文
• 致谢