论文摘要
[背景与目的]胰腺癌的发病率占恶性肿瘤的1%—5%,近年来在世界范围内有明显增多的趋势,其传统的治疗方法主要是手术切除为主,放疗和化学药物联合治疗。虽然经改良手术方法,改变放疗化疗策略,进行综合治疗,但结果并不令人满意,胰腺癌患者死亡率仍然居高不下,其五年生存率低于5%。近年来随着分子生物学,基因免疫学的进步,人们从基因、免疫学的角度对胰腺癌的发病机制有了新的认识,为胰腺癌的治疗提供了新途径、新方法。胰腺癌基因治疗被认为是继手术、放疗和化疗等传统疗法之后肿瘤治疗的新模式,各国专家学者正在探究胰腺癌的生物学行为,发现胰腺癌基因改变在胰腺癌浸润转移中发挥主要作用,胰腺癌的浸润及转移也是一个基因变化逐步积累的过程。端粒（telomere）是真核线性染色体末端结构,由端粒DNA和端粒结合蛋白组成。端粒酶（telomerase）是由RNA和蛋白质组成的核糖核酸蛋白酶,是一种RNA依赖的DNA聚合酶。具有活性的端粒酶由一个RNA亚基和几个蛋白组份构成。RNA亚基（humantelomerase RNA,hTR）含有端粒DNA复制的模板。蛋白组分包括具有催化活性的端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）和端粒酶相关蛋白1（human telomerase-associated protein 1,hTEP1）。hTR和hTEP1在很多正常人组织中都有表达,而hTERT则表达于细胞永生化过程中具有端粒酶活性的细胞中,在细胞的癌变过程中起关键作用。大多数肿瘤中可以检测到端粒酶的活性,而在正常人体组织中却无表达,提示端粒酶是一种广泛的肿瘤标志物。近年来通过检测胰液中端粒酶活性诊断胰腺癌的研究有了很大进展,发现胰腺癌患者胰液中端粒酶活性远高于慢性胰腺炎和良性肿瘤。端粒酶基因可被认为是癌基因的一个重要成员。人类端粒酶逆转录酶（human telomerase reversetranscriptase,hTERT）是由1132个氨基酸残基组成,分子量为127kDa。端粒酶的活性与hTERT基因表达水平高度相关,它能被多种转录因子,癌基因及抑癌基因调控。新近的研究表明hTERT的高表达能通过多分化刺激来抑制细胞凋亡,导致细胞永生化。封闭或下调hTERT表达能引起端粒缩短,破坏染色体稳定性而抑制细胞生长并促进细胞凋亡,逆转肿瘤细胞恶性表型。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是存在于真核细胞内的一种自我保护现象,RNA干扰主要发生在基因转录后,即mRNA的修饰或翻译水平上,具有特异、高效和持久的特点。早期的RNA干扰试验大多使用的是化学合成的siRNA（small interference RNA）,通过RISC对相应的RNA进行特异性降解,可以连续地对新产生的RNA发挥作用,因而具有所需药物少、效率高、持续时间长、特异性强的优点。本研究利用基因工程技术,将人hTERT-siRNA序列插入pSilencer4.1CMV neo,构建重组质粒pSilencer4.1CMVneo-hTERT-siRNA,从体内和体外两个方面研究该重组质粒对人胰腺癌细胞生长的抑制作用,为靶向hTERT的siRNA的临床应用研究奠定基础。迄今,以pSilencer4.1CMVneo为载体的重组质粒pSilencer4.1CMVneo-hTERT-siRNA抗人胰腺癌的研究尚未见报道。[方法]1.设计hTERT-siRNA,设计出的靶向siRNA在GenBank中进行BLASTTM分析,选取序列;siRNA表达模板的合成;空载体pSilencer4.1-CMV neo依次用HindⅢ及BamHI酶切;DNA片段快速纯化回收试剂盒回收酶切后的大片段;酶切后的载体去磷酸化;hTERT-siRNA表达载体构建;重组质粒的酶切及测序鉴定2.pSilencer4.1-CMV neo hTERT-siRNA转染BxPC-3细胞及阳性细胞筛选;分组后48h hTERT基因表达的RT-PCR检测;MTT法检测重组质粒转染BxPC-3细胞48h后对细胞活力的影响;流式细胞术检测各组48h（T1组、T2组、Lipofectamine组、错配组、细胞对照组）细胞周期及凋亡发生情况。各组细胞48h端粒酶蛋白表达的Western-blot检测3.裸鼠成瘤及实验分组:接种BxPC-3细胞0.2ml于裸鼠背部皮下,建立人原发性胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型,待肿瘤生长至直径约5mm时,将荷瘤裸鼠随机分为四组,①肿瘤对照组②空载组（即pSilencer4.1-CMVneo空质粒组）:分组当天瘤体内直接注射pSilencer4.1-CMVneo空质粒(20μg·0.1ml-1·只-1),每10天注射1次,连续注射3次。③T1组（即重组质粒pSilencer4.1-CMVneo-hTERT1-siRNA组）:分组当天瘤体内直接注射重组质粒pSilencer4.1-CMVneo-hTERT1-siRNA,20μg·0.1ml-1·只-1每10天注射1次,连续注射3次。④T2组（即重组质粒pSilencer4.1-CMVneo-hTERT2-siRNA组）:分组当天瘤体内直接注射重组质粒pSilencer4.1-CMVneo-hTERT2-siRNA,20μg·0.1ml-1·只-1每10天注射1次,连续注射3次。荷瘤裸鼠分组处理30天后,测量瘤体大小,计算肿瘤体积,然后脱颈处死裸鼠,用电子天平称取瘤重。HE染色光镜组织形态学观察各组裸鼠皮下肿瘤组织学特点及裸鼠心、肝、脾、肺、肾、胰腺组织的病理形态学变化以及是否出现转移病灶。电镜观测各组肿瘤组织超微结构变化。RT-PCR检测各组瘤体中hTERT、Bcl-2、BaxmRNA的表达。免疫组织化学检测各组瘤体中Bcl-2、Bax、p53、VEGF、端粒酶蛋白表达。Western blot检测各组瘤体中端粒酶蛋白表达情况。[结果]1.合成的T1、T2两对寡核苷酸单链退火形成双链。2%琼脂糖凝胶进行电泳。结果显示两片段均为55bp,琼脂糖凝胶电泳图显示清晰条带。琼脂糖凝胶电泳初步鉴定重组质粒:重组质粒在0.8%琼脂糖凝胶电泳图上于预期位置出现阳性条带与实验预想一致,初步鉴定正确。测序结果表明siRNA表达模板成功构建于pSilence4.1 CMV载体上,序列完全正确。2.琼脂糖凝胶电泳结果显示:重组体pSilencer4.1-CMV neo-hTERT-siRNA T1、T2组BxPC-3中hTERT-mRNA的表达较Lipofectamine组、阴性对照组和细胞组BxPC-3细胞中hTERT-mRNA表达量显著下降。GAPDH组未见明显条带显示。MTT结果显示:T1、T2对BxPC-3细胞有明显生长抑制作用,而Lipofectamine组、阴性对照组及细胞对照组对细胞生长基本无抑制作用。T1组和T2组与Lipofectamine组、阴性对照组及细胞对照组相比,存在明显差异,具有统计学意义（P＜0.05）。而T1组和T2组间比较,差异不明显（P＞0.05）,Lipofectamine组、阴性对照组及细胞对照组三组间比较,差异不明显（P＞0.05）。流式细胞术检测结果显示:T1组和T2组BxPC-3细胞株,G0/G1期细胞比例增高,S期和G2/M期细胞比例降低,细胞的增殖活力明显降低。Lipofectamine组、细胞对照组和错配组的BxPC-3细胞的增殖活力无明显改变。Lipofectamine组、细胞对照组和错配租的BxPC-3细胞细胞发生凋亡比率较低,而T1组和T2组细胞凋亡比例显著增加。各组细胞经Western blot检测分析表明,内参照GAPDH为均一显影的条带,但Telomerase蛋白显影条带密度不同。其中,Lipofectamine组、细胞对照组和错配组BxPC-3细胞端粒酶蛋白表达量较高,而T1、T2组细胞端粒酶蛋白表达量显著下降。3.各组荷瘤裸鼠分组处理30天后,裸鼠存活率为100%。处死全部裸鼠,肉眼观察:全部裸鼠体表淋巴结及腹腔淋巴结未见转移,亦未见腹膜转移及腹水,心、肝、脾、肺、肾、胰腺组织亦均未见转移灶。HE染色光镜下可见肿瘤对照组和空载组肿瘤细胞特点与原细胞株基本一致,肿瘤成分叶结节状生长,质地较韧,包膜完整。T1组、T2组移植瘤HE染色见瘤组织癌细胞密度减少,细胞皱缩,间质结缔组织增多,伴轻度纤维化改变,部分癌巢发生程度不等片状坏死。有的散在坏死癌巢中无细胞结构。四组裸鼠以上各脏器HE染色病理形态学变化基本为正常形态变化。分组处理30天后各组裸鼠皮下移植瘤体积及瘤重差异较显著,T1组及T2组肿瘤体积及瘤重较肿瘤对照组和空载组均差异显著（P＜0.01）。T1组及T2组间比较无明显差异（P＞0.05）,肿瘤对照组及空载组组间比较亦无明显差异（P＞0.05）。各组裸鼠肿瘤超微结构:在肿瘤对照组和空载组,肿瘤细胞BxPC-3细胞表面微绒毛样突起较多,细胞核大而不规则,核内有假包含体。核仁明显而大,形状不规则,核仁可紧贴核膜,常染色质丰富。细胞器较少,线粒体数量不多,线粒体嵴较少,排列也不规则。能见到粗面内质网,但数量较少,部分细胞内能见到微丝样物质,核分裂像常见,细胞核质比较大,为典型恶性肿瘤细胞的形态特征。T1组和T2组BxPC-3细胞超微结构发生了明显变化,细胞表面微绒毛减少或消失,部分线粒体肿胀,同时见胞质密度增加,核染色质浓缩成二个或几个大的团块边聚于核被膜下,进而核裂解为碎块,可见凋亡小体。分组处理30天后,T1组和T2组hTERT,Bcl-2,Bax mRNA表达较肿瘤对照组和空载组均有显著性差异（P＜0.01）。T1组及T2组间比较无明显差异（P＞0.05）,肿瘤对照组及空载组组间比较亦无明显差异（P＞0.05）。分组处理30天后,T1组和T2组Bcl-2,Bax,Telomerase,p53,VEGF蛋白表达较肿瘤对照组和空载组均有显著性差异（P＜0.01）。T1组及T2组间比较无明显差异（P＞0.05）,肿瘤对照组及空载组组间比较亦无明显差异（P＞0.05）。Western blot结果显示:重组质粒pSilencer4.1-CMVneo-hTERT-siRNA作用后,T1组和T2组Telomerase蛋白表达条带强度较肿瘤对照组和空载组明显减弱,蛋白表达差异较显著。而T1组和T2组间比较以及肿瘤对照组和空载组间比较差异均不明显。[结论]1.以hTERT基因为靶点的siRNA序列设计合理,成功获得两条片段均为55bp的hTERT1-siRNA和hTERT2-siRNA。2.经酶切及测序鉴定证实hTERT1-siRNA和hTERT2-siRNA表达模板分别成功构建于pSilence4.1CMV neo载体上,获得两条重组质粒pSilencer4.1-CMV neo-hTERT1-siRNA和pSilencer4.1-CMV-neo-hTERT2-siRNA,序列完全正确。3.重组质粒pSilencer4.1CMV neo-hTERT-siRNA能特异性的诱导同源互补的mRNA降解,下调hTERTmRNA和端粒酶蛋白的表达水平,具有良好的RNAi沉默效应。4.重组质粒pSilencer4.1 CMV neo-hTERT-siRNA明显抑制BxPC-3胰腺癌细胞的生长,细胞周期发生阻滞,促进细胞凋亡,具有一定的体外抗胰腺癌作用。5.重组质粒pSilencer4.1CMV neo-hTERT-siRNA能在裸鼠体内有效抑制BxPC-3胰腺癌细胞皮下移植瘤的生长,促进胰腺癌细胞凋亡,具有体内抗胰腺癌的作用。6.重组质粒pSilencer4.1CMV neo-hTERT-siRNA能够显著下调裸鼠移植瘤体内抗凋亡基因hTERT mRNA、Bcl-2 mRNA和蛋白、mtp53和端粒酶蛋白表达水平,上调促凋亡基因Bax mRNA和蛋白表达水平,其抗胰腺癌作用可能与促进胰腺癌细胞凋亡有关。7.重组质粒pSilencer4.1 CMV neo-hTERT-siRNA能够显著下调裸鼠移植瘤体内VEGF蛋白表达水平,可能具有抑制肿瘤血管生成的作用。8.hTERT基因的表达水平与某些癌基因、抑癌基因的表达水平可能存在一定程度的相关性,有待进一步深入证实。