论文摘要
骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）起源于中胚层,主要存在于哺乳动物的骨髓中,与造血干细胞（Hemopoietic stem cells,HSCs）共存。BMSCs不仅参与构建造血微环境,发挥支持造血的作用,而且易于体外分离培养和扩增、可自体移植并具有跨胚层分化为多种细胞类型的能力,未分化的或经遗传修饰过的BMSCs有望成为未来细胞/基因治疗、组织工程的理想种子细胞。本研究目的在于阐明兔BMSCs的生物学特性,优化兔BMSCs的增殖培养条件,并研究其分化为脂肪细胞的潜能,以便未来利用该类细胞作为疾病细胞和基因治疗的模型。为此,本试验利用一月龄日本大白兔为对象,较为系统全面地研究了其BMSCs的分离、培养、扩增、鉴定、形态学、生长特性及体外诱导分化能力,为进一步深入研究BMSCs的诱导分化和应用打下实验基础。1.本试验应用红细胞裂解液法,根据骨髓间充质干细胞在培养瓶中贴壁生长的特点,成功分离得到兔股骨和胫骨MSCs,体外培养至第7代。本试验所分离的兔BMSCs,增殖能力强,体外适应性较好,通过绘制细胞生长曲线、测定24h贴壁率得出,随着传代次数的增多,增殖能力下降,贴壁时间延长,选用前4代传代细胞作为进一步的研究对象最为合适;经免疫组化实验得出兔BMSCs表面标志CD90、CD44阳性表达,CD34阴性,可初步鉴定所分离的细胞为兔BMSCs,为进一步的实验奠定基础。2.本试验通过四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）比较不同培养基及血清浓度对兔BMSCs生长的影响,结果发现不加血清时,细胞在LG-DMEM和DMEM/F12中的生长速度没有显著差异（ P >0.05）,加血清后,细胞在DMEM/F12中的生长速度均比在LG-DMEM中的生长速度快（P﹤0.05）,其中兔骨髓间充质干细胞在DMEM/F12+20%FBS培养基中生长速度最快。另外,在LG-DMEM+10% FBS培养液中添加碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）,通过MTT法来检测bFGF对体外培养的兔骨髓MSCs增殖的影响,结果表明,bFGF具有促进体外培养的兔BMSCs增殖的作用,其促增殖效应与其质量浓度关系密切:5～20μg/L效应不明显（P>0.05）,在40～100μg/L时促增殖效应显著（P <0.05）,在80μg/L时其促增殖效应最强（P <0.01）。通过检测细胞周期分析bFGF促进兔BMSCs增殖的机理,结果表明,添加bFGF组的细胞中处于S+G2/M期（增殖指数）的细胞百分率为（32.83±1.47）%,与对照组（17.19±1.38）%相比明显增加（P﹤0.01）。3.联合应用地塞米松、胰岛素体外诱导兔BMSCs向脂肪细胞分化,诱导7d后细胞内有脂滴,随着时间延长,脂滴逐渐增加并融合为脂泡,细胞体积逐渐增大由原来的长梭形变为椭圆形或多角形,胞核被挤向一侧,油红O染色呈阳性,从而建立了MSCs分化为脂肪细胞的模型,有助于研究肥胖发生的机制。同时,这也是和骨髓造血干细胞的区别之一。
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标签：骨髓间充质干细胞论文; 碱性成纤维细胞生长因子论文; 脂肪细胞论文; 分化论文;