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胰高血糖素样肽类似物的聚乙二醇化修饰筛选及活性评价

2020-12-11阅读(592)

胰高血糖素样肽类似物的聚乙二醇化修饰筛选及活性评价

论文摘要

研究目的:利用化学合成的方法获得C末端突变成半胱氨酸的Byetta类似物（Ex4C）,再用不同分子量大小的马来酰亚胺活化的mPEG（MAL-mPEG）对其半胱氨酸的游离巯基进行定点修饰,修饰后产物用阴离子交换色谱和反相色谱进行纯化。通过测定其体外刺激RINm5F细胞释放cAMP的水平,以及体内对db/db模型小鼠的降血糖作用来评价其生物活性。以期获得一种长效促胰岛素分泌肽修饰物。研究方法:（1）利用化学合成的方法获得C末端突变成半胱氨酸的Byetta类似物（Ex4C）。①Ex4C纯度检测,包括RP-HPLC,SEC-HPLC方法的建立.②Ex4C质量研究,包括质谱分子量,游离半胱氨酸的脱巯基验证。③马来酰亚胺活化的mPEG（MAL-mPEG）质量研究,包括RP-HPLC-ELSD,SDS-PAGE碘染方法的建立（2） Ex4C的MAL-mPEG修饰研究。包括修饰比例,修饰方法,游离PEG检测。（3） MAL-mPEG-Ex4C分离纯化研究。包括疏水层析、凝胶过滤层析、反相层析,阳离子交换层析。（4） MAL-mPEG-Ex4C药理学研究。包括MAL-mPEG-Ex4C在猕猴体内的初步药代学研究,体外刺激RINm5F细胞释放cAMP水平,体内对db/db模型小鼠的降血糖作用研究。研究结果:（1）Ex4C分子量和理论值完全一致,纯度达98%以上,半胱氨酸游离巯基完全暴露;mPEG（MAL-mPEG）纯度达92%以上,分子量和理论值完全一致（2）MAL-mPEG-Ex4C经修饰条件研究,修饰率达80%以上。且建立了游离PEG检测方法。（3）MAL-mPEG-Ex4C经纯化条件研究,完全除去修饰的Ex4C单体,二聚体,游离的PEG,以及高分子PEG,纯化后纯度达98%以上（4）MAL-mPEG-Ex4C药理学研究结果显示,促胰岛素分泌肽经5k、20k、35k分子量大小的mPEG修饰后体外刺激RINm5F细胞释放cAMP的ED50分别为1.61ng/ml、15.68ng/ml、32.95ng/ml。20k-MAL-mPEG-Ex4C在猕猴体内半衰期为2.63天,且对db/db模型小鼠具有明显的降血糖作用。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 英文缩略表
  • 第一章 引言
  • 1.1 研究背景及意义
  • 1.2 研究现状
  • 1.2.1 胰高血糖素样肽的基本结构研究
  • 1.2.2 胰高血糖素样肽应用进展研究
  • 1.2.3 PEG 相关长效修饰剂的进展研究
  • 1.3 研究目的
  • 1.4 研究内容及技术路线
  • 1.4.1 研究内容
  • 1.4.1.1 利用化学合成的方法获得改构的Ex4C 多肽
  • 1.4.1.2 Ex4C 的PEG 定点修饰
  • 1.4.1.3 MAL-mPEG-Ex4C 的分离纯化
  • 1.4.1.4 MAL-mPEG-Ex4C 的制剂研究
  • 1.4.1.5 MAL-mPEG-Ex4C 的药效学研究
  • 1.4.1.5.1 MAL-mPEG-Ex4C 体外生物活性研究
  • 1.4.1.5.2 MAL-mPEG-Ex4C 体内生物活性研究
  • 1.4.2 技术路线
  • 第二章MAL-mPEG-Ex4C 的修饰研究
  • 2.1 材料与仪器
  • 2.1.1 实验材料
  • 2.1.1.1 主要试剂
  • 2.1.1.2 主要仪器
  • 2.1.1.3 主要试剂配制
  • 2.2 实验方法
  • 2.2.1 Ex4C 多肽的获得
  • 2.2.1.1 Ex4C 化学合成原理
  • 2.2.1.2 Ex4C 合成过程
  • 2.2.1.3 Ex4C 的纯化
  • 2.2.1.4 Ex4C 的二聚体形成
  • 2.2.2 MAL-mPEG 的获得
  • 2.2.2.1 MAL-mPEG
  • 2.2.2.2 MAL-mPEGSDS-PAGE 碘染电泳
  • 2.2.2.3 HPLC-ELSD 蒸发光检测
  • 2.2.2.3.1 主要材料
  • 2.2.2.3.2 实验方法
  • 2.2.2.4 SEC-HPLC 检测
  • 2.2.2.4.1 主要材料
  • 2.2.2.4.2 实验方法
  • 2.3 MAL-mPEG-Ex4C 的修饰
  • 2.3.1 MAL-mPEG-Ex4C 定点修饰方法研究
  • 2.4 结果和讨论
  • 2.4.1 Ex4C 制备结果
  • 2.4.2 MAL-mPEG 检测结果
  • 2.4.3 MAL-mPEG-Ex4C 的修饰结果
  • 第三章 MAL-mPEG-Ex4C 纯化工艺及相关质量研究
  • 前言
  • 3.1 材料与仪器
  • 3.1.1 主要试剂
  • 3.1.2 主要仪器
  • 3.2 Phenyl Sepharose F.F.层析试验方法
  • 3.3 Sephacryl S-100 HR 层析试验方法
  • 3.4 Source 15RPC 纯化
  • 3.5 SP Sepharose F.F 层析试验方法
  • 3.6 结果和讨论
  • 3.6.1 Phenyl Sepharose F.F.层析试验结果
  • 3.6.2 Sephacryl S-100 HR 层析试验结果
  • 3.6.3 Source 15RPC 纯化结果
  • 3.6.4 SP Sepharose F.F 层析试验结果
  • 3.6.5 纯化工艺回收率
  • 3.7 MAL-mPEG-Ex4C 相关质量研究
  • 3.7.1 MAL-mPEG-Ex4C 纯度
  • 3.7.1.2 MAL-mPEG-Ex4C 质量肽图
  • 3.7.1.3 MAL-mPEG-Ex4C 质谱分子量
  • 第四章MAL-mPEG-Ex4C 体内外生物活性研究
  • 4.1 MAL-mPEG -Ex4C 体外生物活性测定
  • 4.1.1 实验材料及相关试剂配制
  • 4.1.2 实验方法
  • 4.1.3 实验结果
  • 4.2 MAL-mPEG -Ex4C 初步药代动力学研究
  • 4.2.1 材料与方法
  • 4.2.1.1 实验材料
  • 4.2.1.1.1 实验动物
  • 4.2.1.1.2 供试品、试剂和仪器
  • 4.2.2 实验方法
  • 4.2.2.1 标准曲线制备
  • 4.2.2.2 动物实验
  • 4.2.3 数据处理
  • 4.2.4 结果
  • 4.2.4.1 标准曲线
  • 4.2.4.2 药时曲线数据
  • 4.2.4.3 药时曲线
  • 4.2.4.4 主要药动参数
  • 4.2.5 小结
  • 4.2.6 讨论
  • 4.3 MAL-mPEG -Ex4C 初步药效学研究
  • 4.3.1 试验材料
  • 4.3.2 动物
  • 4. 3.2.1 实验动物来源
  • 4.3.2.2 实验动物验收及标记
  • 4.3.2.3 实验动物检疫及适应性观察
  • 4.3.2.4 实验动物饲养观察环境条件
  • 4.3.2.5 饲料
  • 4.3.2.6 垫料
  • 4.3.2.7 饮水
  • 4.3.2.8 主要仪器
  • 4.3.2.9 主要试剂
  • 4.3.3 试验方法
  • 4.3.3.1 给药
  • 4.3.3.2 血糖检测
  • 4.3.3.3 绘制单次给药血糖-时间效应曲线
  • 4.3.3.4 多次给药降糖作用及药效学相关指标测定
  • 4.3.3.5 统计方法
  • 4.3.4 结果
  • 4.3.4.1 一般状况观察
  • 4.3.4.2 对体重的影响
  • 4.3.4.3 对摄食量和饮水量的影响
  • 4.3.4.5 单次给药对血糖影响的时效关系
  • 4.3.4.6 多次给药降糖作用
  • 4.3.4.7 对口服葡萄糖耐量的影响
  • 4.3.4.8 对血清糖化血红蛋白和糖化血清蛋白水平的影响
  • 4.3.4.9 对血清脂质成分水平的影响
  • 4.3.4.10 胰岛素测定结果
  • 4.3.4.11 对脏器重量/系数的影响
  • 4.3.5 小结
  • 第五章 结论与展望
  • 5.1 结论
  • 5.2 本文的创新性
  • 5.3 展望
  • 致谢
  • 参考文献
  • 个人简历、在学期间发表的学术论文及取得的研究成果

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