凝乳酶高产菌株的诱变选育及其发酵产酶条件的响应面法优化

论文摘要

本论文以凝乳酶产生菌蓝色刺孢霉为出发菌株,对其分离纯化。通过显微镜观察,确定了制备新培养的孢子所需时间。研究不同剂量的紫外线与硫酸二乙酯单因子对单孢子悬浮液的致死率,利用紫外线、硫酸二乙酯单因子及复合因子诱变处理出发菌株,筛选变异菌株并对其进行遗传稳定性试验,分析发酵液的凝乳酶酶活（MCA）与蛋白水解活性（PA）,得到MCA/PA比值高的优良高产菌株。以优良菌株为菌种,单因素试验确定影响产酶条件的因素和水平,PB试验研究不同因子的显著性,BB试验分析显著因子间的交互作用,最终获得最优发酵产酶条件。主要研究结果如下:（1）对蓝色刺孢霉平板分离得到纯化菌株,显微镜观察发现培养6d孢子铺满斜面,确定制备新培养孢子所需的时间。（2）研究不同剂量的紫外线与硫酸二乙酯单因子对蓝色刺孢霉的致死率得出:单孢子悬浮液,紫外线（UV）照射4min,硫酸二乙酯（DES）作用40min,致死率均为70%～80%,为理想的诱变剂量。（3）对单孢子悬浮液不同方式诱变,分别为UV诱变、DES诱变、先UV后DES诱变和先DES作用后UV诱变。随机挑取不同方式诱变后的30株菌编号,摇瓶筛选变异菌株,进行遗传稳定性试验及发酵液MCA/PA比值分析,DU12为最优的高产菌株。（4）培养基单因素试验表明:最适碳源为葡萄糖,最佳氮源为蛋白胨,酵母膏既可作为氮源又含有生长因子,MnSO4、吐温-80、CaCl2能提高发酵液品质,起始pH、装液量、接种量、培养温度、转速和发酵时间对发酵产酶品质也有影响。（5） PB试验显示转速、葡萄糖和pH是影响产酶条件的显著因子;BB试验表明葡萄糖与pH交互作用不明显,而葡萄糖与转速、pH与转速交互作用明显。响应面法优化的产酶条件为:葡萄糖35g,蛋白胨4g,酵母膏6g,CaCl20.5g,MnSO4 2.5mg,吐温-80 0.8g,pH 5.0,蒸馏水补足1000mL,分装250mL三角瓶50mL灭菌,接种1%孢子悬浮液,温度30℃,转速188r/min,培养96h,发酵液凝乳酶酶活可达610.52 SU/mL.

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 引言
• 1.1 凝乳酶简介
• 1.2 凝乳酶产生菌
• 1.3 发酵凝乳酶工艺的优化
• 1.4 展望
• 1.5 本课题的立题依据和研究主要内容
• 1.5.1 立题依据
• 1.5.2 研究的主要内容
• 第2章 凝乳酶高产菌株诱变条件的选择
• 引言
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 实验仪器
• 2.1.4 实验试剂
• 2.1.5 实验方法
• 2.1.5.1 单孢子悬液的制备方法
• 2.1.5.2 凝乳酶活力（MCA）测定方法
• 2.1.5.3 出发菌株纯化
• 2.1.5.4 孢子形成时间的确定
• 2.1.5.5 诱变剂的选择
• 2.1.5.6 硫酸二乙酯（DES）诱变剂量的确定
• 2.1.5.7 紫外线（UV）照射时间的确定
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 出发菌株的确定
• 2.2.2 孢子形成的时间
• 2.2.3 诱变剂量的选择
• 2.2.3.1 硫酸二乙酯（DES）处理时间的确定
• 2.2.3.2 紫外线（UV）照射时间的确定
• 2.3 本章小结
• 第3章 凝乳酶高产菌株的诱变处理及筛选
• 引言
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 实验仪器
• 3.1.4 实验试剂
• 3.1.5 实验方法
• 3.1.5.1 DES 诱变
• 3.1.5.2 UV 诱变
• 3.1.5.3 先UV 后DES 诱变
• 3.1.5.4 先DES 后UV 诱变
• 3.1.5.5 初筛方法
• 3.1.5.6 复筛方法
• 3.1.5.7 凝乳酶活力（MCA）测定方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 初筛方法的选择
• 3.2.2 凝乳酶高产菌株的初筛
• 3.2.2.1 硫酸二乙酯（DES）诱变初筛
• 3.2.2.2 紫外线（UV）诱变初筛
• 3.2.2.3 先UV 后DES 诱变初筛
• 3.2.2.4 先DES 后UV 诱变初筛
• 3.2.3 凝乳酶高产菌株的复筛
• 3.3 本章小结
• 第4章 遗传稳定性试验与发酵产酶品质的分析
• 引言
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 实验仪器
• 4.1.4 实验试剂
• 4.1.5 实验方法
• 4.1.5.1 遗传稳定性试验
• 4.1.5.2 凝乳酶酶活（MCA）测定方法
• 4.1.5.3 蛋白水解活性（PA）的测定
• 4.1.5.4 变异菌株发酵液颜色的比较
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 变异菌株遗传稳定性试验
• 4.2.2 蛋白酶活力测定标准曲线
• 4.2.3 不同菌株发酵产酶品质的研究
• 4.2.4 变异菌株发酵液颜色的变化
• 4.3 本章小结
• 第5章 影响凝乳酶高产菌株发酵产酶条件的因素研究
• 引言
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 菌种
• 5.1.2 培养基
• 5.1.3 实验仪器
• 5.1.4 实验试剂
• 5.1.5 试验方法
• 5.1.5.1 发酵产酶品质的分析
• 5.1.5.2 培养基组分调整的方法
• 5.1.5.3 培养条件调整的方法
• 5.1.5.4 葡萄糖标准曲线的制作及发酵液残糖的测定
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 碳、氮源及其浓度对发酵产酶的影响
• 5.2.1.1 不同碳源及葡萄糖浓度对产酶的影响
• 5.2.1.2 不同氮源对及蛋白胨浓度对产酶的影响
• 5.2.1.3 酵母膏浓度对产酶的影响
• 5.2.2 金属离子、乳化剂及其浓度对发酵产酶的影响
• 5.2.2.1 金属离子与表面活化剂的选择
• 2 浓度对产酶的影响'>5.2.2.2 CaCl₂浓度对产酶的影响
• 4 浓度对产酶的影响'>5.2.2.3 MnSO₄浓度对产酶的影响
• 5.2.2.4 吐温-80 浓度对产酶的影响
• 5.2.3 培养条件对发酵产酶的影响
• 5.2.3.1 起始pH 对产酶的影响
• 5.2.3.2 装液量对产酶的影响
• 5.2.3.3 接种量对产酶的影响
• 5.2.3.4 培养温度对产酶的影响
• 5.2.3.5 转速对产酶的影响
• 5.2.3.6 培养时间对产酶的影响
• 5.2.3.7 葡萄糖标准曲线的绘制及发酵液残糖分析
• 5.3 本章小结
• 第6章 凝乳酶高产菌株发酵产酶条件的响应面法优化
• 引言
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 菌种
• 6.1.2 培养基
• 6.1.3 实验仪器
• 6.1.4 实验试剂
• 6.1.5 试验方法
• 6.1.5.1 凝乳酶酶活（MCA）测定方法
• 6.1.5.2 Plackett-Burman 法筛选产酶显著因子
• 6.1.5.3 Box-Behnken 法研究显著因子交互作用与最优产酶条件
• 6.1.5.4 标准溶液的配制方法
• 6.1.5.5 最优发酵产酶条件的验证
• 6.2 结果与讨论
• 6.2.1 筛选对产酶影响的显著因子
• 6.2.1.1 Plackett-Burman 试验的因素与水平
• 6.2.1.2 Plackett-Burman 试验设计与结果
• 6.2.1.3 Plackett-Burman 试验的结果分析
• 6.2.2 显著因子间交互作用的研究及产酶条件优化
• 6.2.2.1 Box-Behnken 试验的因素与水平
• 6.2.2.2 Box-Behnken 试验设计与结果
• 6.2.2.3 Box-Behnken 试验的结果分析
• 6.2.2.4 Box-Behnken 试验优化的产酶条件
• 6.2.2.5 验证试验
• 6.3 本章小结
• 第7章 全文结论与展望
• 7.1 全文总结
• 7.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 在学期间主要科研成果