抗肿瘤药物对人胃癌细胞体外增殖及小鼠胚胎体外发育的影响

论文摘要

近年来的研究表明，许多人类难以治愈的疾病（如自身免疫性红斑狼疮）和肿瘤都与细胞基因组DNA甲基化异常有着密切的联系。随着DNA甲基化研究的深入，人们发现，一些核苷类抗肿瘤药物可以改变某些肿瘤细胞（如肝癌细胞、Hela细胞）基因组DNA的甲基化模式，使这些病变的肿瘤细胞得以逆转。因此，这种策略已经成为临床治疗肿瘤的一个新途径。本论文首先研究了5-氟尿嘧啶及5-氮杂胞苷两种核苷类抗肿瘤药物对人胃癌细胞体外增殖的影响，目的在于探究这两种药物抑制胃癌细胞增殖的效果。随后，以分子生物学技术为手段，研究了这两种药物对人胃癌细胞基因组DNA甲基化模式的影响，目的在于探究这两种药物的抑癌机理。最后，以小鼠为实验模型，研究了这两种药物对其早期胚胎体外发育的影响，以期为患胃癌的妊娠期妇女能否服用这两种抗肿瘤药物提供前期的实验结果。具体的研究内容及结果如下：1.采用含不同浓度上述两种药物的1640培养液，体外培养人胃癌细胞株（MGC-803）。首先采用MTT（3-（4,5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3,5-diphenytetrazoliumromide）法检测了这两种药物对细胞体外增殖的影响。结果表明，随着5-氟尿嘧啶浓度的升高，细胞的吸光度值（absorbance，A值）逐渐减小，各处理组与对照组之间的A值均差异显著（P<0.05）；而5-氮杂胞苷处理后的细胞，其A值虽有降低的趋势，但各处理组与对照组之间的A值均差异不显著（P>0.05）。随后，进一步采用细胞计数法验证上述结果的正确性。结果表明，5-氟尿嘧啶处理后的细胞，在处理的第2天时就呈现一种凋亡的趋势，各处理组与对照组之间均差异显著（P<0.05）。此外，随着5-氟尿嘧啶浓度的增大，细胞凋亡的趋势虽有所增大，但各处理组之间均差异不显著（P>0.05）。不同浓度5-氮杂胞苷处理后的细胞，其凋亡趋势不明显，甚至有继续增殖的趋势，但在处理的第3天时，其凋亡的趋势与MTT法检测的结果相一致。此外，随着5-氮杂胞苷处理天数的增加，细胞凋亡的趋势越趋明显，在处理的第8天时，各处理组与对照组之间及多个处理组之间均差异显著。2.采用甲基敏感扩增多态性（methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）技术检测了经两种药物处理后的人胃癌细胞基因组DNA甲基化模式的改变。结果表明，随着这两种药物浓度的增加，人胃癌细胞基因组DNA的全甲基化、半甲基化及总甲基化水平总体呈现增加、降低及增加的趋势，各处理组与空白对照组之间及多个处理组之间均差异显著（P<0.05）。3.以小鼠为实验模型，研究了这两种药物对小鼠早期胚胎发育及胎儿畸形发育的影响。结果表明，培养液中添加这两种药物均能严重阻遏早期胚胎的体外发育，且阻遏程度随药物浓度的增加而增加；给妊娠母鼠注射这两种药物同样会阻遏胚胎的体外发育，处理组中的胚胎没有一枚能够发育到4-细胞期；而给妊娠母鼠注射两种药物，少数胚胎如果能够耐受药物的作用继续发育，则发育到期的小鼠不会表现出畸形表型。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1.1 DNA 甲基化
• 1.1.1 DNA 甲基化类型
• 1.2 DNA 甲基化与肿瘤
• 1.2.1 抗肿瘤药物与 DNA 甲基化的关系
• 1.3 DNA 甲基化的研究方法
• 1.3.1 基因组整体甲基化分析方法
• 1.3.2 特定 DNA 片段甲基化检测方法
• 1.3.3 其它甲基化分析方法
• 第二章 抗肿瘤药物对人胃癌细胞体外增殖的影响
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料与试剂
• 2.1.2 人胃癌细胞的体外培养
• 2.1.3 MTT 法测定两种药物对人胃癌细胞体外增殖的影响
• 2.1.4 细胞计数法测定两种药物对人胃癌细胞体外增殖的影响
• 2.1.5 数据处理
• 2.2 结果
• 2.2.1 人胃癌细胞生长形态观察
• 2.2.2 MTT 法测定 5-氟尿嘧啶对人胃癌细胞体外增殖的影响
• 2.2.3 MTT 法测定 5-氮杂胞苷对人胃癌细胞体外增殖的影响
• 2.2.4 直接计数法测 5-氟尿嘧啶对人胃癌细胞体外增殖的影响
• 2.2.5 直接计数法测 5-氮杂胞苷对人胃癌细胞体外增殖的影响
• 2.3 讨论
• 2.4 结论
• 第三章 抗肿瘤药物对人胃癌细胞基因组DNA 甲基化模式的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料与试剂
• 3.1.2 人胃癌细胞基因组 DNA 的提取
• 3.1.3 基因组 DNA 的酶切体系
• 3.1.4 连接体系
• 3.1.5 预扩增体系
• 3.1.6 选择性扩增体系
• 3.1.7 结果检测
• 3.1.8 结果判定
• 3.1.9 条带统计
• 3.1.10 统计分析
• 3.2 结果
• 3.2.1 MSAP 检测的预扩增结果
• 3.2.2 MSAP 检测的选择性扩增结果
• 3.2.3 DNA 甲基化数据统计分析结果
• 3.3 讨论
• 3.4 结论
• 第四章 抗肿瘤药物对小鼠早期胚胎发育的影响
• 4.1 实验材料与方法
• 4.1.1 材料与试剂
• 4.1.2 小鼠超数排卵
• 4.1.3 胚胎采集
• 4.1.4 5-氟尿嘧啶对体外培养的小鼠胚胎发育的影响
• 4.1.5 给妊娠母鼠直接注射 5-氟尿嘧啶对其早期胚胎发育的影响
• 4.1.6 从表型上观察 5-氟尿嘧啶对小鼠胎儿畸形发育的影响
• 4.1.7 5-氮杂胞苷对体外培养的小鼠胚胎发育的影响
• 4.1.8 给妊娠母鼠直接注射 5-氮杂胞苷对其早期胚胎发育的影响
• 4.1.9 实验数据分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 激素剂量对小鼠超排的影响
• 4.2.2 体外培养胚胎的发育
• 4.2.3 培养液中添加 5-氟尿嘧啶对小鼠早期胚胎体外发育的影响
• 4.2.4 妊娠母鼠注射 5-氟尿嘧啶对小鼠早期胚胎体外发育的影响
• 4.2.5 培养液中添加 5-氮杂胞苷对小鼠早期胚胎体外发育的影响
• 4.2.6 妊娠母鼠注射 5-氮杂胞苷对小鼠早期胚胎体外发育的影响
• 4.2.7 妊娠母鼠注射两种药物对小鼠胎儿畸形发育的影响
• 4.3 讨论
• 4.4 结论
• 参考文献
• 附录A 主要仪器设备
• 附录B 溶液配方
• 在学研究成果
• 致谢