论文摘要
幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H. pylori）为微需氧菌,是一端有鞭毛的螺旋形革兰氏阴性菌,已确认该菌与胃肠道4种疾病即慢性胃炎、消化性溃疡、胃粘膜相关性淋巴瘤（gastric mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma, MALT）及胃癌密切相关。全球H. pylori的人群感染率超过50%。根除H. pylori不仅可以加速溃疡的愈合、减少溃疡复发,而且可以降低胃癌发生的危险性。由于根除疗法的推广应用,H. pylori对部分抗生素的耐药性变得日益严重,已明显影响到部分H. pylori的治疗方案根除率。因此,幽门螺杆菌耐药基因的检测对判断耐药性,指导临床用药,具有重要指导价值。克拉霉素是根除H. pylori最有效的抗生素,随着克拉霉素在临床的广泛应用,H. pylori对克拉霉素的耐药率逐渐增高,明显降低了含克拉霉素方案的根除率。研究表明5%～20%的患者对克拉霉素耐药。克拉霉素耐药可以使根除率降低55%,因此临床上迫切需要一种快速、准确地诊断H. pylori对克拉霉素耐药的检测方法。分子方法检测H. pylori对克拉霉素耐药性是一种快速、准确的方法。国内外研究报道,H.pylori对克拉霉素耐药的产生与23SrRNA结构的改变有关。23SrRNA结构的改变是由于23SrRNA基因上的单核苷酸多态性（single nucleotidepolymorphism,SNP）引起的,最常见的位置为2143或者2142。所以细菌对克拉霉素的耐药性可以通过检测特定位置的SNP获得。等位基因特异性引物-聚合酶链反应（allele specific primer-polymerase chain reaction,ASP-PCR）是检测单核苷酸多态性（SNPs）的方法之一,可以应用PCR扩增方法短时间内检测SNPs,不再需要限制性内切酶进行酶切或对产物的直接测序。ASP-PCR方法特意设计引物3’末端的第三个碱基为错配碱基;设计3’末端的第二个碱基为SNP位点的互补碱基。当第二个碱基与SNP位点上的碱基互补结合时,PCR的扩增可以继续进行,反之则不能。这样SNPs可以通过观察相应的特异性引物的PCR扩增产物有或无来确定。国外研究报道, 23SrRNA基因的点突变分别产生了BsaI、BbsI新的酶切位点。口腔中H. pylori的生存,可能为胃内H. pylori再感染的来源。通过牙菌斑取材,检测幽门螺杆耐药基因具有简单,快速,便于临床开展的特点,具有较强的临床价值。目的:本实验通过胃粘膜取材建立等位基因特异性引物-聚合酶链反应法（ASP-PCR）检测H. pylori23S rRNA基因2142及2143位置上SNPs,进而获知H. pylori的突变耐药情况;建立巢式PCR方法检测牙菌斑中H. pylori的感染及其23S rRNA基因突变情况。方法:1采集2006年6月至2006年11月因上消化道症状行胃镜检查的患者83例,其中包括16例慢性胃炎、60例溃疡和7例胃癌患者,男性49例,平均年龄为47岁。H. pylori的诊断依据快速尿素酶试验、组织学检查及14C呼气试验,此三项中两项阳性为H. pylori阳性患者,两项阴性为H. pylori阴性患者。83例患者（65例H. pylori阳性,18例H. pylori阴性）的胃粘膜提取DNA,均经过ASP-PCR和巢式PCR两种方法扩增,巢式PCR产物经BsaI和BbsI进行酶切。采用SPSS12.0软件包进行统计分析,两种方法阳性率的比较采用χ2检验。2收集14C呼气试验和快速尿素酶试验均为H. pylori阳性的患者45例,包括慢性浅表性胃炎23例,十二指肠溃疡22例。取其牙菌斑,提取DNA,用巢式PCR方法扩增H. pylori 23S rRNA的425bp片段,阳性结果用限制性内切酶BsaI和BbsI进行酶切。结果:1采用ASP-PCR法65例H. pylori阳性患者58例为野生株,1例发生A2143G突变, 6例为野生株与A2143G突变株的混合株。所有突变株均经测序证实。突变率10.8%,准确性100%。巢式PCR法扩增65例H. pylori阳性患者56例为阳性,18例H. pylori阴性患者17例为阴性。对57例巢式PCR阳性产物进行限制性酶切分析,有7例被BsaⅠ切开,表明存在A2143G的突变,无一例被BbsⅠ识别。所有突变株均经测序证实。2 45例H. pylori阳性患者25例牙菌斑在第一轮PCR扩增出了H. pylori 23S rRNA 617bp的片断,（阳性扩增率为55.6%）,而28例在第二轮PCR扩增出了425bp的片段（阳性扩增率为62.2%）。对28例巢式PCR阳性产物进行限制性酶切分析,有1例被BsaⅠ切开,表明存在A2143G的突变,无一例被BbsⅠ识别。所有突变株均经测序证实。结论:1采用ASP-PCR方法可以简便的检测到胃粘膜中H. pylori23S rRNA的SNPs（2142、2143位置上腺嘌呤突变为鸟嘌呤）,不需要酶切及测序即可获知H. pylori对克拉霉素耐药的情况。2采用特定的内外引物,用巢式PCR方法扩增H. pylori 23S rRNA的425bp片段,其中包括与克拉霉素耐药有关的点突变位点,可以同时检测牙菌斑H. pylori的感染及对克拉霉素耐药的情况。