水稻产量QTL位点LRK基因簇的基因功能研究及其下游互作蛋白的筛选

论文摘要

有效分蘖数、每穗粒数和千粒重是构成水稻产量的三要素。这些因素的变异呈连续分布,呈现数量遗传的特性。这些性状受多个位点（quantitative trait loci,QTLs）的影响,并且它们的表达受环境和遗传背景的修饰。由于其复杂性,只有少部分调控这些性状的基因被分离和证实。先前,我们通过图位克隆的方法从以东乡野生稻（Oryza,rufipogon Griff.）为供体与以桂朝2号（Oryza sativa L.ssp.Indica）为受体的BC4F2群体中获得了一个与水稻高产有关的QTL位点qGY2-1,试验证明这个QTL位点促进水稻谷粒子增加从而对产量的贡献率达到16%。基因结构分析表明这个QTL位点由LRK1-LRK8（leucine-rich repeat receptor-likekinase,LRK）,八个编码富含亮氨酸重复序列型类受体激酶新基因所组成的基因簇。有意思的是东乡野生稻的基因簇中包含LRK1基因,而贵朝2号基因簇中这个基因缺失。所以我们选用东乡野生稻的LRK1基因进行研究,数据显示LRK1在根、茎、叶、幼穗中有都表达;亚细胞定位实验表明LRK1蛋白定位于质膜上。将LRK1基因导入缺失LRK1基因的籼稻9311（Oryza sativa L.subsp.indica vat.9311）中过表达,结果发现过表达LRK1基因降低了株高,促进了细胞分裂和植株生长,提高了水稻有效分蘖数、每穗粒数、二次支梗数,因此我们推测LRK1基因与植株分枝发育有关。最终的统计结果显示LRK1基因提高了水稻的单株产量达58%。水稻因为基因组比较小（390Mb）,目前基因组测序已经完成,而成为单子叶植物的模式植物。对LRK1基因功能的分析不仅有利于对水稻产量形成机制的理解,同时也促进对其他作物的产量形成的分子机制的认识。为了验证同一基因簇中其他同源基因是否具有相似的功能,我们选择了LRK6和LRK7构建于不同的表达载体进行过表达研究,研究结果表明LRK6和LRK7具有与LRK1相似的功能,LRK6和LRK7都促进了植物的生长,对水稻有效分蘖数的贡献分别为38.1%,27.86%。单株粒数分别增加了49%,36.36%。LRKs在植物生长发育和抗性反应中起着广泛的调节作用。为了探索LRK1基因在细胞内的互作蛋白,我们将LRK1基因的胞内域构建成诱饵质粒采用酵母双杂的方法筛选籼稻9311的cDNA文库,获得了与LRK1互作的翻译延伸因子eIF-1A（translation elongation factor）蛋白,这种相互作用在酵母中得到了证实,其体内试验还在进行中。我们初步推测LRK1基因通过促进蛋白质翻译发挥其生理功能。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 第一章 水稻富含亮氨酸重复序列型类受体激酶基因LRK1转化水稻的研究
• 1.1 材料与试剂
• 1.1.1 水稻品种
• 1.1.2 质粒及菌株
• 1.1.3 主要生化及分子生物学试剂
• 1.1.4 用于水稻组织培养的培养基
• 1.1.5 主要仪器与设备
• 1.1.6 分析软件
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 工具酶及其使用
• 1.2.2 限制性内切酶
• 1.2.3 T4噬菌体DNA连接酶
• 1.2.4 质粒DNA的操作
• 1.2.5 LRK1基因的克隆
• 1.2.6 表达载体的构建
• 1.2.7 基因枪法转化水稻
• 1.2.8 转基因植株的PCR鉴定
• 1.2.9 Southem杂交分析
• 1.2.10 半定量与实时定量PCR分析LRK1基因的表达
• 1.3 结果与讨论
• 1.3.1 转基因阳性植株PCR检测
• 1.3.2 转基因阳性植株Southem blot分析
• 1.3.3 转基因阳性植株RT-PCR半定量和实时定量分析
• 第二章 水稻富含亮氨酸重复序列型类受体激酶基因LRK1的功能分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 材料与仪器
• 2.1.2 核酸及蛋白质序列分析软件
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 转基因材料的性状分析
• 2.2.2 组织表达谱分析
• 2.2.3 蛋白亚细胞定位观察
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 LRK1基因的序列与基因结构分析
• 2.3.2 LRK1基因的组织表达分析
• 2.3.3 LRK1基因的亚细胞定位
• 2.3.4 过表达LRK1基因促进植物的生长
• 2.3.5 过表达LRK1基因促进植物的分蘖力
• 2.3.6 过表达LRK1基因提高水稻的每穗粒数
• 2.3.7 过表达LRK1基因提高水稻穗部二次支梗数
• 2.3.8 过表达LRK1基因对水稻其他性状的影响
• 2.3.9 过表达LRK1基因促进细胞分裂
• 2.4 讨论与结论
• 第三章 水稻富含亮氨酸重复序列型类受体蛋白激酶LRK6,LRK7的功能分析
• 3.1 材料与试剂
• 3.1.1 材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 DNA操作同第一章
• 3.2.2 LRK6,LRK7基因的克隆
• 3.2.3 表达载体的构建
• 3.2.4 基因枪法转化水稻
• 3.2.5 转基因植株的PCR鉴定
• 3.2.6 半定量RT-PCR分析LRK6,LRK7基因的表达
• 3.3 试验结果
• 3.3.1 LRK6,LRK7基因的序列与基因结构分析
• 3.3.2 LRK6,LRK7基因与其同源基因序列的比对分析
• 3.3.3 LRK6,LRK7在组织中的表达谱分析
• 3.3.4 转基因阳性植株PCR检测
• 3.3.5 过表达LRK6,LRK7促进植物的生长
• 3.3.6 过表达LRK6,LRK7提高水稻的产量
• 3.4 试验结果和讨论
• 第四章 水稻富含亮氨酸重复序列型类受体蛋白激酶LRK1下游互作蛋白的筛选
• 4.1 实验材料和方法
• 4.1.1 水稻材料
• 4.1.2 菌种
• 4.1.3 质粒载体
• 4.1.4 试剂及培养基的配制
• 4.1.5 酵母双杂交筛选与LRK1相互作用的蛋白质
• 4.1.6 pGBKT7-LRK1诱饵质粒的构建
• 4.1.7 pGBKT7-LRK1重组子转化酵母感受态AH109细胞及自激活检测
• 4.1.8 水稻cDNA双杂交文库构建
• 4.1.9 LRK1互作蛋白的筛选
• 4.1.10 酵母质粒的抽提
• 4.2 实验结果
• 4.2.1 构建了酵母双杂文库
• 4.2.2 pGBKT7-LRK1筛选水稻cDNA文库
• 4.2.3 阳性克隆的返回验证
• 4.2.4 eIF-1A的特征
• 4.3 讨论和总结
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表论文