楸子（Malus prunifolia）两个编码RNA结合蛋白基因的初步研究

论文摘要

干旱胁迫是影响植物生长和当今农业生产的最重要的非生物逆境。苹果在我国栽培历史悠久，其面积和产量均居第一，但苹果的栽培区多数在水分缺乏的干旱和半干旱地区。因此研究苹果在干旱胁迫下的响应机理对现实生产具有重要的理论指导作用。根据干旱引起的植物基因编码产物的功能差异将这些基因分为功能基因和调节基因，编码RNA结合蛋白的基因是一类调节基因。本试验是在实验室已建立的楸子（Malus prunifolia（Willd）Borkh.）叶片cDNA文库中选择了两个基因。其中MpGR-RBP1为全长，含有一个516bp的开放阅读框。构建了该基因的植物过表达载体，利用农杆菌介导法转化模式植物番茄Micro-Tom。MpYTH在文库中是一个约1400bp的片段，分析了该基因在干旱和NaCl处理后的特异性表达，设计引物扩增全长并进行序列和结构的分析，同时利用亚细胞定位确定它在细胞中的定位。主要结果如下：1．将MpGR-RBP1基因从克隆载体pMD-19T-simple上切下，定向插入到携带GUS报告基因和潮霉素标记基因的植物表达载体pWR306上，成功构建了MpGR-RBP1植物过量表达载体pWR-GR-RBP。2．在实验室前人建立的番茄Micro-Tom再生体系和潮霉素筛选体系的基础上，利用农杆菌介导法将MpGR-RBP1基因转入番茄，并进行潮霉素的筛选。对得到的25株番茄幼苗进行GUS染色初步认为3株为转基因植株。3．设计引物得到MpYTH基因全长2034bp的开放阅读框，可编码677个氨基酸，理论分子量为73.9KD，理论等电点为8.15，含有一个YT521-B homology domain，二级结构预测含有6个α-螺旋和5个β-片层，为混合型蛋白。4．用携带GFP蛋白的载体pBI-221构建MpYTH亚细胞定位载体，利用基因枪法将载体导入洋葱表皮细胞。荧光显微镜下观察结果显示GFP融合蛋白只存在于细胞核中，推知MpYTH基因是定位于细胞核的基因。5．对进行干旱和NaCl处理后的楸子叶片提取RNA，用特异性引物进行荧光定量PCR。结果显示干旱处理后MpYTH表达量逐步增加，在4d时达到最大值，是处理前的59倍，随着干旱胁迫的加重，表达量逐步下降；NaCl处理后MpYTH表达量逐步上升，在4h时达到最大值，是处理前的10倍，6h时急剧下降后8h时又上升，之后逐步下降。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物对干旱胁迫的适应机理
• 1.1.1 干旱胁迫对植物的伤害
• 1.1.2 干旱胁迫下基因的诱导与表达
• 1.2 两种 RNA 结合蛋白的研究进展
• 1.2.1 GR-RBP 研究进展
• 1.2.2 YTHDF 研究进展
• 1.3 植物遗传转化
• 1.3.1 农杆菌介导法的研究进展
• 1.3.2 影响农杆菌介导法转化效率的因素
• 1.3.2.1 植物种类和外植体类型
• 1.3.2.2 菌液活性和侵染时间
• 1.3.2.3 预培养、共培养时间
• 1.4 本试验的目的及意义
• 第二章 农杆菌介导的 MpGR-RBP1 转化番茄
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料与试剂
• 2.1.2 试验方法
• 2.1.2.1 MpGR-RBP1 过表达载体构建及检测
• 2.1.2.2 番茄子叶准备
• 2.1.2.3 培养基类型
• 2.1.2.4 工程菌培养
• 2.1.2.5 农杆菌侵染及转基因植物获得
• 2.1.2.6 转基因植株的 GUS 检测
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 MpGR-RBP1 过表达载体构建及检测
• 2.2.2 转基因植株的获得
• 2.2.3 转基因植株的 GUS 检测
• 2.3 讨论
• 2.3.1 番茄转基因植株获得
• 2.3.2 转基因植株 GUS 检测
• 第三章 MpYTH 基因的克隆、亚细胞定位及叶片中的表达分析
• 3.1 材料与试剂
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 试剂
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 材料处理
• 3.2.2 MpYTH 基因克隆
• 3.2.2.1 核酸提取
• 3.2.2.2 总 RNA 的反转录
• 3.2.2.3 RT-PCR 反应
• 3.2.2.4 MpYTH 基因克隆
• 3.2.3 生物学信息学分析
• 3.2.4 亚细胞定位
• 3.2.4.1 融合表达载体构建
• 3.2.4.2 融合蛋白 pBI-YTH 在洋葱表皮细胞中的表达
• 3.2.5 荧光定量 PCR 反应
• 3.2.5.1 核酸提取
• 3.2.5.2 引物设计与选择
• 3.2.5.3 总 RNA 的反转录
• 3.2.5.4 荧光定量 PCR 反应
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 MpYTH 克隆
• 3.3.2 MpYTH 序列分析
• 3.3.3 MpYTH 三级结构预测
• 3.3.4 MpYTH 多序列比对及进化树构建
• 3.3.5 MpYTH 基因编码蛋白的跨膜螺旋特征分析
• 3.3.6 MpYTH 基因编码蛋白的亲水性/疏水性预测
• 3.3.7 亚细胞定位载体检测及在洋葱表皮细胞中的表达
• 3.3.8 MpYTH 基因的变化趋势分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 MpYTH 基因的克隆及序列分析
• 3.4.2 MpYTH 基因的亚细胞定位
• 3.4.3 MpYTH 基因的差异性表达
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介