论文摘要
反刍动物甲烷排放会造成能量损失,同时甲烷是主要的温室气体,因此减少反刍动物甲烷的排放越来越成为社会关注的焦点。本试验以富含十八碳不饱和脂肪酸的植物油和十八碳不饱和脂肪酸为试验材料,研究了其对体外发酵、甲烷生成和微生态的影响；在此基础上,选择亚麻酸进一步研究了其对湖羊瘤胃发酵和甲烷生成的影响,并利用实时荧光定量PCR （Real-time quantitative PCR）及变性梯度凝胶电泳（Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE）等技术,研究瘤胃微生物数量及区系结构变化,揭示不饱和脂肪酸降低甲烷排放的微生物学机理。试验一选取三种典型的植物油：菜籽油、豆油和亚麻油,分别添加底物干物质的0%、3%、5%和7%,利用体外培养系统进行体外发酵,研究植物油的类型和添加水平对瘤胃体外发酵和甲烷生成的影响。结果显示,菜籽油对甲烷产量无显著影响（P>0.05）,豆油7%添加水平显著抑制了甲烷生成,而亚麻油所有添加水平均显著降低了甲烷生成量（P<0.05）。在豆油和亚麻油处理组中,随着添加水平的提高,甲烷产量线性下降（P<0.01）。三种植物油均显著改变了瘤胃发酵模式,随着植物油中所含不饱和脂肪酸不饱和度的增加,乙酸和丁酸的摩尔比例显著降低,丙酸摩尔比例显著升高（P<0.05）；植物油添加水平的提高显著降低了乙酸和丁酸摩尔比例,显著升高了丙酸摩尔比例（P<0.05）,乙酸丙酸比例显著降低。植物油的类型和添加水平对发酵类型没有显著的互作效应（P>0.05）。本试验结果表明植物油降低甲烷的效果跟其来源和添加水平有关。试验二利用体外培养系统研究十八碳脂肪酸的类型和添加水平对瘤胃体外发酵、甲烷生成和微生态的影响。四种十八碳脂肪酸：硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸,分别添加底物干物质的0%、3.5%和7.0%,在4、8、12和24h测定产气量和甲烷产量。24 h发酵终止后,分析培养液中氨态氮、挥发性脂肪酸和微生物蛋白含量,并提取发酵液DNA,采用实时荧光定量PCR技术测定甲烷菌、原虫、真菌、黄化瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌的数量。结果显示,十八碳脂肪酸的类型、添加水平及其互作对24h产气量和甲烷产量有显著影响（P<0.001）。与对照相比,十八碳脂肪酸对发酵液pH、氨态氮浓度和总挥发性脂肪酸含量的影响不显著。然而,发酵类型发生了明显改变,随着十八碳不饱和脂肪酸添加水平和不饱和度的增加,发酵液中乙酸比例显著降低,丙酸比例显著升高（P<0.001）亚麻酸和亚油酸显著降低了甲烷菌和原虫数量,且亚麻酸效果最显著。但十八碳不饱和脂肪酸的添加也抑制了纤维分解菌,包括真菌、黄化瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌的生长。以上结果表明,十八碳不饱和脂肪酸抑制甲烷生成可能是由于其对甲烷生成相关菌的抑制而起作用的。试验三利用瘤胃模拟体外产气法研究添加亚油酸与亚麻酸不同比例混合物对瘤胃发酵和甲烷生成的影响。试验共设八个处理,亚油酸与亚麻酸的比例分别为O：0；100：0；80：20；60：40；50：50；40：60；20：80和0：100,每个处理设三个重复。亚油酸与亚麻酸混合物的添加水平为发酵底物干物质的5%,未添加脂肪酸组为对照。所有组合均显著降低产气量和甲烷生成量（P<0.05）,且随着亚麻酸比例的升高效果增强。亚麻酸比例超过40%时显著升高发酵液的pH（P<0.05）；所有处理对氨态氮和微生物蛋白均未产生影响；挥发性脂肪酸随着亚麻酸比例的提高而升高,亚麻酸单独添加显著高于亚油酸单独添加（P<0.05）。随着亚麻酸比例的升高,丙酸比例显著提高。本结果表明,不饱和脂肪酸降低甲烷的生成与不饱和度密切相关。试验四研究亚麻酸在不同底物条件下对瘤胃发酵、甲烷生成和甲烷生成相关菌的影响。采用2×5二因子试验设计,因子一为亚麻酸,分不添加和添加亚麻酸（底物干物质的5%）,因子二为瘤胃培养底物中玉米粉和羊草粉的不同比例,分别为100：0、70：30、50：50、30：70和0：100。结果表明,亚麻酸的添加显著降低了体外产气量和甲烷产量,随着底物中羊草粉的比例增加,产气量和甲烷产量显著降低；亚麻酸和日粮组成及其互作对产气量和甲烷产量均有极显著影响（P<0.01）。添加亚麻酸和底物精粗比及其互作对总挥发性脂肪酸浓度和发酵类型均产生了显著影响（P<0.01）,亚麻酸的添加显著提高了总挥发性脂肪酸含量,而底物羊草比例的增加显著降低了总挥发性脂肪酸含量（P<0.01）。添加亚麻酸显著降低了乙酸和丁酸的摩尔比例,显著升高了丙酸摩尔含量（P<0.01）；随着底物中羊草比例增加,乙酸摩尔比例显著增加,丙酸和丁酸摩尔比例显著降低,乙酸丙酸比例显著增加（P<0.01）。亚麻酸的添加显著降低了甲烷菌和原虫数量,随着底物中粗饲料羊草粉的比例增加,甲烷菌和原虫数量显著升高（P<0.05）；日粮组成和添加亚麻酸对甲烷菌和原虫有显著的互作效应（P<0.05）。本试验表明,添加亚麻酸在不同精粗比底物条件下均显著降低了甲烷生成量,甲烷生成量的降低伴随着丙酸摩尔比例的提高。亚麻酸显著降低了甲烷菌和原虫数量,表明亚麻酸通过降低甲烷生成相关菌从而降低甲烷生成量。试验五在体研究亚麻酸在不同精粗比饲粮条件下对湖羊瘤胃发酵、甲烷生成和微生态的影响。试验采用4×4拉丁方设计,八头湖羊随机分为四组,分别饲喂高粗料、高粗料添加5%亚麻酸、高精料和高精料添加5%亚麻酸日粮。结果表明,日粮类型和添加亚麻酸对甲烷排放有显著影响,添加亚麻酸降低了高粗料和高精料甲烷排放量的17.3%和33.8%。亚麻酸的添加显著升高了瘤胃pH（P<0.05）。日粮类型对挥发性脂肪酸无显著影响（P>0.05）,而添加亚麻酸显著降低了挥发性脂肪酸含量（P<0.05）；亚麻酸的添加在高精料日粮中显著降低了乙酸比例,升高了丙酸比例,但对高粗料日粮下的发酵类型无显著影响。瘤胃微生物对亚麻酸和日粮类型有不同的反应,添加亚麻酸显著降低了甲烷菌和原虫的数量（P<0.05）,而日粮类型及其与亚麻酸的互作对甲烷菌和原虫数量无显著影响；提高精粗比显著抑制了真菌的生长（P<0.05）,而亚麻酸和亚麻酸与日粮类型的互作对真菌数量无显著影响；亚麻酸的添加促进了黄化和白化瘤胃球菌的生长（P<0.05）,但对产琥珀酸丝状杆菌无显著影响；提高精粗比显著降低了白化瘤胃球菌的数量,而对黄化瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌无显著影响。亚麻酸和日粮类型对所有微生物均没有显著的互作效应（P>0.05）。本试验结果表明,亚麻酸在不同类型的日粮条件下均显著降低了甲烷生成量,但程度不同,因此用亚麻酸作为调控甲烷生成的手段时必须考虑日粮的因素。综上所述,富含十八碳不饱和脂肪酸的植物油和十八碳不饱和脂肪酸能显著抑制甲烷生成,改善瘤胃发酵,从而减少反刍动物以甲烷形式损失的能量,为降低温室气体甲烷的排放提供基础理论依据。