真姬菇品种改良及其相关性研究

论文摘要

真姬菇又名白玉、海鲜菇,是一种营养丰富的食用兼药用的珍稀食用菌,也是近年来风靡日本市场,深受消费者青睐的食用菌珍品。该菇形态美观,质地脆嫩,味道鲜美,现已成为全国食用菌工厂化生产的重要品种之一。真姬菇在工厂化生产中存在着栽培周期长（120-150d）、栽培条件苛刻、抗逆性差、产品品质参差不齐等问题,在一定程度上限制了其规模化发展。漆酶具有降解木质素,氧化降解酚类物质,抑制杂菌,改善出菇品质等作用。本研究以漆酶活性较高的云芝和无漆酶活性的真姬菇作为实验材料,采用酶学与原生质体融合相结合的技术,将云芝原生质体经高温灭活与真姬菇原生质体融合,从而得到的高漆酶活性的真姬菇优良品种。本文从9个不同品种的真姬菇菌种,通过在平皿中比较菌丝生长速度、菌丝浓密、长势,筛选出生长速度快、菌丝致密、长势旺盛的白玉作为出发菌株；从9个不同品种的灵芝菌种,通过比较各菌种在RB亮蓝-PDA中的变色圈和变色速度,筛选出变色圈大和变色速度强的云芝作为出发菌株。然后以筛选得到的白玉和云芝作为出发菌株,对它们进行原生质体制备、再生的实验,结论如下：白玉原生质体制备和再生最佳条件是：2%溶壁酶处理3h,RM2为再生培养基；云芝原生质体制备和再生的最佳条件是：3%的溶壁酶酶解3h,RM2为再生培养基。接着,将制备好的云芝原生质体采用55。C水浴45min灭活后,同白玉的原生质体按1：1混合,在32℃下以PEG（4000）为融合剂,处理25min。在再生培养基上生长的融合菌株,采用RB-PDA平板显色技术,筛选出变色圈大和变色速度强的合菌株RH01-RH04。随后比较它们同出发菌株白玉和云芝漆酶活性的差异,复筛出高漆酶的融合菌株RH01。对合菌株RH01-RH04进行拮抗实验,显示融合菌株RH01-RH04同出发菌株间白玉和云芝之间都有明显的拮抗现象,表明它们之间存在不亲和性,初步鉴定属于融合的新菌株。应用RAPD技术和ISSR技术进一步分析,根据扩增的DNA图谱,表明融合菌株RH01～RH04的亲缘关系比较接近白玉,同云芝的遗传差异比较大。融合菌株RH01～RH04连续转接5代后的稳定性显示RH01的稳定性最好。融合菌株RH01生长特性的实验表明：RH01的菌丝形态介于出发菌株白玉和云芝之间；在16x40倍的普通显微镜下观察,菌丝也存在差异；进行霉菌抗耐能力比较,RH0l的拮抗圈最大,表明它的对霉菌抗耐能力最强。生物学特性试验结果：融合菌株RH01的培养基优化试验结果表明在PDA胡萝卜培养基上生长旺盛,活力较强,菌丝浓密、洁白；融合菌株RH01的最适的生长温度为26。C；最适pH值为7.0；RH01在种子瓶中菌丝生长速度为0.31cm/d；出菇实验表明生产周期比白玉短,产量也平均高出2.62g/瓶。

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摘要

ABSTRACT

前言

1 真姬菇概述

1.1 真姬菇简介

1.2 真姬菇的生物学特性

1.2.1 形态特征

1.2.1.1 菌丝体培养特征

1.2.1.2 子实体形态特征

1.2.2 生长特性

1.3 真姬菇的营养价值

2 云芝概述

2.1 云芝简介

2.2 云芝生物学特性

2.2.1 形态特征

2.2.2 生长条件

2.3 云芝的化学成分

2.4 云芝的药理作用

3 漆酶概述

3.1 漆酶简述

3.2 漆酶与食用菌生产

3.3 食用菌中漆酶的检测

4 食用菌育种的现状

4.1 人工选择育种

4.2 诱变育种

4.3 杂交育种

4.4 原生质体技术育种

4.4.1 原生质体单核化技术

4.4.2 原生质体诱变技术

4.4.3 原生质体融合技术

4.4.3.1 原生质体制备

4.4.3.2 融合菌株的选择标记

4.4.3.3 原生质体的融合方法

4.4.3.4 融合菌株的鉴定方法

5 研究意义及研究内容

第一章出发菌株的筛选

1 引言

2 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 供试菌种

2.1.2 培养基

2.1.2.1 试管斜面培养基

2.1.2.2 活化培养基

2.1.2.3 PDA-RB亮蓝初筛培养基

2.1.2.4 产漆酶液体培养基

2.1.3 主要仪器

2.1.4 主要试剂

2.2 实验方法

2.2.1 菌株的活化与保存

2.2.2 高漆酶菌株的初筛

2.2.3 高漆酶菌株的漆酶活性测定

3 结果与分析

3.1 高漆酶菌株的初筛

3.2 初筛菌株的漆酶活性测定结果

4 小结

第二章白玉和云芝原生质体间的融合

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 供试菌种

2.1.2 培养基

2.1.2.1 菌丝固体培养基

2.1.2.2 菌丝液体培养基

2.1.2.3 再生培养基

2.1.2.4 产漆酶液体培养基

2.1.2.5 RB-PDA亮蓝培养基

2.1.3 试剂

2.1.4 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 菌丝的培养

2.2.2 白玉与云芝原生质体的制备

2.2.2.1 原生质体制备的步骤

2.2.2.2 溶壁酶浓度对白玉与云芝原生质体制备的影响

2.2.3 原生质体的再生

2.2.3.1 原生质体的纯化

2.2.3.2 原生质体的再生培养基的选择

2.2.4 云芝和白玉间原生质体融合

2.2.4.1 原生质体的灭活

2.2.4.2 原生质体融合

2.2.5 融合菌株的检验

2.2.5.1 融合菌株的初筛

2.2.5.2 融合菌株的复筛

3 结果与分析

3.1 菌丝的培养

3.2 酶浓度对原生质体制备的影响

3.3 再生培养基的选择

3.4 云芝和白玉间原生质体融合

3.5 融合菌株的检验

3.5.1 融合菌株的初检

3.5.2 融合菌株的复检

3.5.2.1 融合菌株的液体培养

3.5.2.2 融合菌株的漆酶的测定

4 小结

第三章融合菌株的初步鉴定

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 供试菌株

2.1.2 培养基

2.1.3 试剂

2.1.4 实验所用仪器与设备

2.2 方法

2.2.1 拮抗现象

2.2.1.1 供试菌株的活化

2.2.1.2 拮抗试验

2.2.2 融合菌株的分子鉴定

2.2.2.1 菌丝体的培养

2.2.2.2 DNA提取方法

2.2.2.3 DNA浓度的分析

2.2.2.4 RAPD分析

2.2.2.5 ISSR分析

3 结果与分析

3.1 拮抗试验结果

3.2 DNA提取结果

3.3 RAPD分析结果

3.4 ISSR分析结果

4 小结

第四章融合菌株的生物特性初步研究

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 供试菌种

2.1.2 材料及仪器

2.1.2.1 实验材料

2.1.2.2 实验仪器

2.1.3 试剂

2.1.4 供试培养基

2.2 实验方法

2.2.1 融合菌株的遗传稳定性

2.2.2 生长特性

2.2.2.1 融合菌株同亲本菌株的菌落特征比较

2.2.2.2 融合菌株与亲本菌株的菌丝显微结构观察

2.2.2.3 融合菌株与亲本菌株对霉菌抗耐能力比较

2.2.3 生物学特性

2.2.3.1 不同培养基对融合菌株RH01菌丝长速的影响

2.2.3.2 不同温度对融合菌株RH01菌丝长速的影响

2.2.3.3 不同pH值对融合菌株RH01菌丝长速的影响

2.2.3.4 融合菌株RH01在种子瓶中菌丝生长速度

2.2.3.5 融合菌株RH01的出菇实验

3 结果分析

3.1 融合菌株的遗传稳定性

3.2 融合菌株同亲本菌株的菌落特征比较

3.3 融合菌株与亲本菌株的菌丝显微结构观察

3.4 融合菌株与亲本菌株对霉菌抗耐能力比较

3.5 不同培养基对菌丝长速的影响

3.6 不同温度对菌丝长速的影响

3.7 不同pH值对菌丝长速的影响

3.8 融合菌株RH01在种子瓶中菌丝生长速度

3.9 融合菌株RH01的出菇实验

4 小结

参考文献

致谢

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