昆虫神经毒素的表达、抗体制备、活性分析及应用研究

论文摘要

昆虫神经毒素具有控制农业害虫的重要潜在价值,但天然昆虫神经毒素在毒腺中的含量低且提取困难。目前,已开发多种外源基因表达系统,如大肠杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统,为大量获取这类神经毒素提供了有效的表达系统。大肠杆菌表达系统是使用最为广泛的一种原核表达系统,毕赤酵母表达系统是一种高效的真核表达系统,许多基因实现了在大肠杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统中的高效表达。在不改变3种蝎神经毒素AaIT、BjαIT、LqhIT2和1种蜘蛛神经毒素TX（46-1）的蛋白质一级结构的基础上,按照毕赤酵母的密码子偏好性,设计合成了上述四种昆虫神经毒素,并分别克隆至大肠杆菌融合表达载体pET30a（+）和毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K。通过转化大肠杆菌,筛选到了四种昆虫神经毒素的大肠杆菌转化子;其中,三种蝎神经毒素实现了在大肠杆菌中的融合表达,表达产物经镍亲和层析柱纯化,并得到了高纯度融合蛋白;纯化蛋白经免疫注射BALB/c小鼠,制备了三种蝎昆虫神毒素的较高效价的抗血清;其中,AaIT的抗血清最高效价达1:128,000,BjαIT的抗血清最高效价达到1:512,000,LqhI2的抗血清最高效价超过1:128,000,所制备的抗血清均具有较高的特异性。通过提取免疫BjαIT融合蛋白小鼠的脾细胞总RNA,经RT-PCR,在连接肽的连接下,构建了包含抗昆虫神经毒素BjαIT的scFv全长DNA片段库。利用电转化法,四种毒素基因分别成功转化毕赤酵母KM71菌株。利用制备的抗血清,采用斑点杂交的方法,筛选到了较高水平表达的三种蝎昆虫神经毒素的酵母转化子。在甲醇诱导下,实现了AaIT、BjαIT和LqhIT2的分泌表达。表达产物经脱盐、浓缩,以东亚飞蝗和德国小蠊为供试昆虫,对表达产物的生物活性进行了测定。结果表明:三种重组蝎昆虫神经毒素具有体内注射活性。通过引入信号肽,成功将BjαIT基因、BjαIT自身信号肽基因及绿僵菌表达载体连接,构建了超表达载体。超表达载体经基因枪转化绿僵菌分生孢子,筛选到能在除草剂平板上生长的转化子。通过提取转化子基因组DNA,经PCR验证,BjαIT基因成功转化绿僵菌。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 生物农药的定义及前景
• 1.1.1 微生物杀虫剂的特点
• 1.1.2 绿僵菌在防治蝗灾中的优缺点与基因工程改造
• 1.2 国内外研究昆虫神经毒素的历史与现状
• 1.2.1 蝎昆虫神经毒素研究进展
• 1.2.2 蜘蛛昆虫神经毒素研究进展
• 1.3 各种表达系统的特点
• 1.3.1 细菌（大肠杆菌）表达系统
• 1.3.2 毕赤酵母表达系统
• 1.3.3 哺乳动物细胞表达载体系统
• 1.3.4 昆虫杆状病毒表达系统
• 1.4 制备抗体的必要性
• 1.5 供试昆虫的选择
• 2 毒素基因在大肠杆菌中的表达、纯化及抗血清的制备
• 2.1 材料、设备及各种溶液的配方
• 2.1.1 菌株、质粒及抗生素
• 2.1.2 材料、试剂、各种溶液配方和培养基
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 昆虫神经毒素基因的扩增
• 2.2.2 PCR 产物的回收
• 2.2.3 表达载体pET-30a（+）小量抽提
• 2.2.4 大肠杆菌表达载体的构建
• 2.2.5 JM109 菌株及BL21（DE3）菌株电转化感受态细胞的制备
• 2.2.6 大肠杆菌表达载体电转化JM109 菌株
• 2.2.7 阳性转化子的筛选、测序并转化BL21（DE3）菌株
• 2.2.8 诱导表达
• 2.2.9 包涵体的提取
• 2.2.10 融合蛋白的镍亲和纯化
• 2.2.11 多克隆抗体的制备
• 2.2.12 Western blotting 检测抗血清的特异性
• 2.2.13 融合蛋白的活性分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 大肠杆菌融合表达转化子的检测
• 2.3.2 大肠杆菌融合表达的SDS-PAGE 分析
• 2.3.3 大肠杆菌融合表达的纯化
• 2.3.4 抗体滴度的测定与提取血清
• 2.3.5 抗体特异性验证
• 2.3.6 活性分析
• 2.4 讨论分析
• 2.4.1 影响表达水平的主要因素
• 2.4.2 包涵体提取
• 2.4.3 多克隆抗体制备
• 2.4.4 生物活性分析
• 3 抗BjαIT 毒素scFv 基因库的构建
• 3.1 抗体的基本结构
• 3.2 技术路线
• 3.3 实验材料
• 3.3.1 主要仪器
• 3.3.2 主要试剂
• 3.3.3 部分试剂配制
• 3.4 方法与操作
• 3.4.1 分离小鼠脾细胞
• 3.4.2 提取脾细胞总RNA
• 3.4.3 VH、VL 及linker 的扩增
• 3.5 结果与分析
• 3.5.1 总RNA 提取及质量测定
• 3.5.2 RT-PCR 扩增VH、VL
• 3.5.3 linker 的扩增
• 3.5.4 全长片段的获取
• 3.6 讨论与展望
• 3.6.1 免疫小鼠
• 3.6.2 总RNA 的提取
• 3.6.3 重链和轻链的扩增
• 3.6.4 重链和轻链的连接
• 4 蝎昆虫神经神经毒素在P. pastoris 中的表达
• 4.1 材料、设备和各种溶液配方
• 4.1.1 质粒、菌株及抗生素
• 4.1.2 消耗材料及试剂、溶液和培养基配方
• 4.1.3 主要仪器设备
• 4.2 方法
• 4.2.1 目的基因的设计
• 4.2.2 酵母转化子的获取
• 4.2.3 高水平表达菌株的筛选
• 4.2.4 最佳收获时间的确定
• 4.2.5 扩大诱导表达
• 4.2.6 表达产物的Western-blotting 分析
• 4.2.7 AaIT 表达产物的快速纯化
• 4.2.8 表达产物的活性分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 重组表达质粒的构建
• 4.3.2 高表达转化子的筛选
• 4.3.3 高表达菌株的 SDS-PAGE 银染分析
• 4.3.4 表达产物的Western blotting 分析
• 4.3.5 最佳收获期的确定
• 4.3.6 AaIT 的纯化及生物活性测定
• 4.3.7 BjαIT 生物活性测定
• 4.3.8 LqhIT2 生物活性测定
• 4.4 讨论
• 4.4.1 P. pastoris 表达系统的特点及其对表达的影响
• 4.4.2 毒素在P. pastoris 中表达的影响因素
• 4.4.3 重组昆虫神经毒素纯化及存在的问题
• 4.4.4 生物活性分析
• 5 BjαIT 转化绿僵菌的初步研究
• 5.1 材料、设备和各种溶液配方
• 5.1.1 质粒、菌株及抗生素
• 5.1.2 主要仪器设备
• 5.1.3 主要试剂和培养基
• 5.2 方法
• 5.2.1 BjαIT 绿僵菌超表达分载体的构建
• 5.2.2 超表达载体转化金龟子绿僵菌分生孢子
• 5.2.3 转化子的除草剂初筛
• 5.2.4 转化子的PCR 验证
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 超表达载体的构建和鉴定
• 5.3.2 金龟子绿僵菌CQMa102 转化子的除草剂筛选
• 5.3.3 转化子的PCR 验证
• 5.4 讨论与展望
• 6 主要研究结论及后续工作建议
• 6.1 主要研究结论
• 6.2 后续工作建议
• 致谢
• 参考文献
• 附录