shRNA沉默RPS14基因对MDS细胞株SKM-1细胞增殖的影响

论文摘要

目的：骨髓增生异常综合征（Myelodysplastic syndrome, MDS）是一组起源于多能造血干/祖细胞的异质性恶性血液疾病，以高风险向急性白血病转化为其特征，故又俗称白血病前期（Preleukemia，PL）。目前本病的发病机制尚未阐明，缺乏有效的治疗手段。因此，探索MDS的分子发病机制，寻找MDS的有效治疗手段具有重要意义。MDS最常见的染色体缺失是5号染色体长臂的缺失，所有伴有del（5q）的MDS患者染色体缺失区域均含有5q31-5q32区带，称为共缺失区域（commondelete region, CDR）。对CDR的基因测序研究未发现显性突变，均表现为基因表达量的下降。其中，位于该区域的RPS14基因，是单倍剂量减少的抑癌基因，近年研究表明，伴有del（5q）的MDS患者体内RPS14基因表达水平下降。而对于5号染色体表型正常的MDS患者体内RPS14基因表达变化是否也具有同样的意义目前尚未有研究报道。因此，研究RPS14在MDS发生发展中的作用具有重要意义。本实验通过构建RPS14基因RNAi慢病毒载体（Lentiviral Vector，LV），观察该基因在人MDS细胞株SKM-1细胞中的表达，并将构建成功的重组慢病毒载体RPS14-shRNA转染人MDS细胞株SKM-1细胞，使目的基因在靶细胞内表达沉默。以便深入研究RPS14基因对MDS细胞内生物学行为的影响。通过细胞增殖率变化等方法观察RPS14基因表达沉默后对SKM-1细胞增殖的影响。方法：1、RPS14基因RNAi慢病毒载体RPS14-shRNA的构建及鉴定：选用新型慢病毒载体pGC-SIL-GFP，首先设计合成RPS14互补脱氧核糖核酸（Complementary deoxynucleic acid，cDNA）的PCR产物与线性化慢病毒载体相连接，产物经测序鉴定确认，与包装质粒共转染293T细胞，产生重组慢病毒载体RPS14-shRNA，逐孔稀释法测定病毒滴度；采用流式细胞仪检测转染效率，Western blot检测转染前后目的细胞内RPS14蛋白的表达变化。2、重组慢病毒载体RPS14-shRNA转染SKM-1细胞后对其增殖影响的研究：将重组慢病毒载体RPS14-shRNA转染SKM-1细胞（转染组），同时设立未转染组（SKM-1）、空载体转染组，应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定各组细胞的光密度值（Optical density，OD）。结果：1、本实验成功构建了重组慢病毒载体RPS14-shRNA，滴度达2.0×109TU/ml,构建的慢病毒载体能够高效率的转染SKM-1细胞，100感染复数（Multiplicity of infection，MOI）的重组慢病毒载体对SKM-1细胞的转染效率约为58.26%，Western blot检测显示转染后靶细胞RPS14蛋白的表达水平明显低于转染前，实验组与对照组比较具有统计学意义（P＜0.01）。2、重组慢病毒载体RPS14-shRNA转染SKM-1细胞后抑制其增殖：转染48h、72h、96h,收集各组细胞，MTT法检测各组细胞的OD值,转染重组慢病毒载体后对SKM-1细胞的生长有抑制作用，与空载体转染组相比具有统计学意义（P＜0.05）。结论1、慢病毒载体可以高效率的转染血液肿瘤细胞，对血液肿瘤的分子治疗具有重要的临床应用价值。2、对于5号染色体表型正常的MDS细胞株SKM-1细胞RPS14基因表达沉默可抑制其增值。3、本研究结果表明RPS14基因在MDS的发生发展中起着重要作用。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 RPS14 基因 RNAi 慢病毒载体的构建和鉴定
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二部分 RPS14 基因的沉默对 SKM-1 细胞增殖的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间发表的论文