阿特拉津降解菌ADH-2的分离鉴定及其降解特性的研究

论文摘要

阿特拉津是均三氮苯类内吸传导型除草剂,阿特拉津在世界范围内已经使用了40多年,目前仍然是应用广泛的化学除草剂之一。因其长时间大范围使用,造成大面积的土壤、地表水、地下水等环境的污染。阿特拉津在土壤和水体中的持留期较长并具有生物蓄积性,不但对粮食和食品安全构成了潜在威胁,而且会扰乱和破坏生物活性,对生态环境的影响具有全球性.本论文的研究目的是通过富集培养的方法分离阿特拉津污染土壤中的降解菌,并在国内外阿特拉津的微生物降解研究的基础上对这些降解菌的降解特性、降解基因和生物修复进行较为系统的研究。为开发和应用酶制剂提供基础。阿特拉津降解菌的分离与鉴定:从长期施用阿特拉津的玉米地中采集土样,通过富集培养的方法分离出一株能以阿特拉津为唯一碳氮源生长的细菌ADH-2,结合生理生化特性及16S rRNA基因的相似性分析将其初步鉴定为节杆菌属（Arthrobacter sp.）。降解菌生长特性和降解特性的研究:ADH-2在淀粉和蔗糖中生长最好,对麦芽糖的利用不是很好,最适氮源为有机氮,该菌在10h内对100mg/L阿特拉津的降解率为99%,pH值4-10范围内都能有效地降解阿特拉津,降解率受通气量值影响很小。通过与本实验室另外两株阿特拉津降解菌比较,菌株ADH-2具有更好的应用潜力。ADH2以阿特拉津为唯一碳氮源生长时,降解终产物为氰尿酸。降解菌降解基因的研究:对其降解基因的初步研究显示,该菌含有trzN、atzB和atzC三个阿特拉津降解相关基因与报道的其它菌中相应序列相似性分别为99%、100%、99%;采用PCR扩增从ADH-2中可以扩增到trzN全基因序列,与C190的trzN序列相似性为99%。为了研究trzN,我们把它克隆到表达载体pET29a并转化E.coli BRL21（DE3）,本研究中,大部分蛋白以包涵体的形式存在,几乎检测不到活性。为了克服这些困难,我们把trzN整合到大肠杆菌-枯草杆菌分泌表达载体pP43NMK上,该载体带有P43启动子功能片段和nprB基因信号肽编码序列,然后转化B.subtilis WB800,trzN得到了表达。该酶在20℃-30℃、pH＞6.0的条件下比较稳定;在pH7.3和30℃时显示最大的阿特拉津水解酶活性;大多数金属离子浓度在0.2 mmol/L时对其酶活有促进作用。菌株ADH-2在土壤中降解阿特拉津效果及影响因素的研究:在阿特拉津浓度约为50μg/g干土的黄棕壤,接种1.7×107CFU/g干土的ADH-2,10 d后接菌土壤中阿特拉津浓度都远低于对照土壤。表明ADH-2能在不同的土壤中有效降解阿特拉津,土壤水分含量对降解效果影响较大,大于20%时降解效果比较好。不同的接种量对降解效果有一定影响,pH对降解效果影响不大。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献综述
• 1 概述
• 1.1 阿特拉滓的施用现状
• 1.2 理化性质
• 1.3 阿特拉滓的生态毒理学
• 2 阿特拉津的危害
• 2.1 对农业生产的影响
• 2.2 对动植物的影响
• 2.3 对人类的影响
• 3 阿特拉津的生物降解
• 3.1 细菌
• 3.2 真菌
• 3.3 藻类
• 4 阿特拉津的微生物代谢途径
• 5 模式菌株Pseudomonas sp.ADP阿特拉津降解酶系和降解基因的研究
• 6 生物修复研究进展
• 7 芽孢杆菌表达系统概述
• 7.1 芽孢杆菌表达系统的特点
• 7.2 革兰氏染色与基因表达
• 7.3 关于表达酶的方面
• 参考文献
• 第一章 阿特拉津降解菌的分离与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株、试剂及污染土壤样品
• 1.2 阿特拉滓及其代谢产物的检测
• 1.3 菌种的纯化分离
• 1.4 降解菌的培养特征及生理生化鉴定
• 1.5 降解菌的16S rDNA序列的PCR扩增及测序
• 1.6 降解菌系统发育地位的确定与系统发育关系的研究
• 1.7 抗生素抗性试验
• 2 结果与分析
• 2.1 降解菌ADH-2的分离纯化
• 2.2 ADH-2的培养及生理生化鉴定结果
• 2.3 降解菌系统发育定位
• 2.4 ADH-2降解阿特拉津的产物
• 2.5 抗生素实验结果
• 3.本章小结
• 参考文献
• 第二章 降解菌生长和降解特性的研究
• 1.材料与方法
• 1.1 供试菌株
• 1.2 培养基
• 1.3 菌种制备及菌体生长量的测定方法
• 1.4 阿特拉津降解产物检测
• 1.5 降解菌碳源、氮源利用及最适碳氮比试验
• 1.6 降解菌利用阿特拉津生长情况试验
• 1.7 pH对菌株ADH-2降解阿特拉津的影响
• 1.8 通气量对菌株ADH-2降解阿特拉津的影响
• 2.结果与讨论
• 2.1 降解菌碳源、氮源谱及最适碳氮比
• 2.2 ADH-2的生长和阿特拉津降解的关系
• 2.3 pH值对降解菌生长和降解的影响
• 2.4 通气量对降解的影响
• 3 本章小结
• 第三章 降解菌ADH-2降解基因的克隆及其表达
• 第一节 降解菌ADH-2降解基因的克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株、质粒、酶及抗生素
• 1.2 养基
• 1.3 种培养条件
• 1.4 引物合成
• 1.5 细菌总DNA的小量提取见第一章
• 1.6 质粒DNA小量提取
• 1.7 大肠杆菌普通感受态细胞的制备及转化
• 1.8 PCR扩增反应体系
• 1.9 PCR产物T/A克隆与基因序列的测序
• 2 结果与分析
• 第二节 阿特拉津氯水解酶基因在大肠杆菌中的表达和酶活力检测
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 酶和引物
• 1.3 培养基
• 1.4 粒载体的线性化及目的基因的酶切
• 1.5 阿特拉津氯水解酶trzN的诱导表达
• 1.6 阿特拉津氯水解酶的活力测定
• 2 结果与讨论
• 2.1 trzN基因表达载体及菌株的构建
• 2.2 trzN基因在大肠杆菌表达系统中的表达
• 2.3 酶活力检测结果
• 3 本章小结
• 第三节 利用P43启动子和NprB信号肽编码序列构建高效分泌表达载体重组表达trzN基因
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 酶和引物
• 1.3 培养基
• 1.4 穿梭分泌表达载体pP43T的构建
• 1.5 枯草杆菌感受态细胞的制备及转化
• 1.6 粗酶液的制备
• 1.7 酶活力检测
• 1.8 温度对酶促反应的影响
• 1.9 pH对酶促反应的影响
• 1.10 金属离子对酶促反应的影响
• 2 结果与分析
• 2.1 穿梭分泌表达载体pP43T的质粒电泳验证
• 2.2 表达蛋白的SDS-PAGE检测
• 2.3 酶活力检测
• 2.4 温度对酶促降解的影响
• 2.5 pH对酶促降解的影响
• 2.6 金属离子对酶活性的影响
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 菌株ADH-2在土壤中降解阿特拉津的效果和影响因素的研究
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2.结果与分析
• 2.1 灭菌和未灭菌土壤中阿特拉津的降解
• 2.2 土壤pH值对降解的影响
• 2.3 降解菌接种量对降解效果的影响
• 2.4 土壤水分含量对降解效果的影响
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 参考文献
• 全文总结
• 本文创新之处
• 附录1 文中所用缩写
• 附录2 实验用培养基及分子生物学试剂
• 附录3 枯草杆菌普通化学感受态细胞制备用试剂
• 附录4 相关DNA序列
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 致谢