ω-醇溶蛋白基因的克隆及通过RNAi抑制小麦α-醇溶蛋白基因家族表达研究

论文摘要

小麦醇溶蛋白主要赋予面粉的粘性。目前,已从普通小麦（Triticum aestivum）中克隆了大量的α-、γ-醇溶蛋白基因,但是已克隆的ω-醇溶蛋白基因数量还很少。根据小麦属ω-醇溶蛋白基因设计了一对简并引物,以体细胞杂种渐渗系Ⅱ-12及其亲本小麦Jinan 177和十倍体长穗偃麦草的gDNA为模板,扩增得到了16个ω-醇溶蛋白基因序列,长度变化为924～1146bp。其中,6个序列中因为含有编码框内提前终止密码子,因此可能是假基因。这些序列与已知的ω-醇溶蛋白基因序列有高度的相似性。通过分析ω-醇溶蛋白基因推导的氨基酸序列发现ω-醇溶蛋白由两侧短的N-端与C-端保守区及中间长重复可变区组成。系统进化分析表明这些ω-醇溶蛋白基因聚为三个亚家族：第一个包括来源于5个长穗偃麦草和1个Ⅱ-12的序列,表明至少有一个长穗偃麦草ω-醇溶蛋白基因通过体细胞杂交渗入Ⅱ-12中；第二个包括3个来自Ⅱ-12和6个来自于Jinan177的序列,它们都属于ARQ/E型ω-醇溶蛋白基因；第三个由三个来自于普通小麦的SRL型ω-醇溶蛋白基因组成。我们还发现,来自于第二亚家族的Ⅱ-12的一个ω-醇溶蛋白基因在其C端有一个Cys位点,这可能使其与面粉品质相关。所以我们预测,通过体细胞渐渗的方式使得杂种Ⅱ-12产生了新的ω-醇溶蛋白基因。乳糜泻（coeliac disease）是患者进食麦类食品后,对其中的醇溶谷蛋白不耐受而引起的慢性小肠吸收不良综合症,而α-醇溶蛋白含有大量可导致乳糜泻疾病的毒性肽段。本论文通过对已发布的α-醇溶蛋白基因进行聚类,找出它们保守性较强的片段,根据本实验室得到的一个来自于体细胞杂种渐渗系Ⅱ-12的α-醇溶蛋白基因设计引物,经PCR扩增得到保守性片段作为干扰α-醇溶蛋白基因家族的出发序列,并构建了RNA干扰真核表达载体p3301-Ubi-AR12与p3301-Ubi-AR34。通过农杆菌介导的转化方法,分别将上述两个载体转化小麦株系,经PCR筛选后,初步得到了30株阳性株系。利用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳分别对这三十株阳性株系的种子进行了醇溶蛋白组成的分析检测,发现其中有六株籽粒表现出明显的α-醇溶蛋白干扰现象。为进一步研究RNA干扰是否对植株的高、低分子量谷蛋白亚基产生影响,我们通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对上述六株产生RNA干扰效应的植株进行分析,发现它们的HMW-GS组成与对照相比没有发生改变,而LMW-GS发生了一定程度的改变。这为进一步研究RNA干扰技术在小麦谷蛋白的功能提供了理论基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 文献综述
• 1.1 小麦种子储藏蛋白的组成及分类
• 1.2 小麦醇溶蛋白的染色体定位
• 1.3 α-、ω-醇溶蛋白的研究现状
• 1.3.1 α-醇溶蛋白
• 1.3.2 ω-醇溶蛋白
• 1.3.3 α-、ω-醇溶蛋白同乳糜泻疾病之间的关系
• 1.4 RNA干扰技术与小麦遗传育种的关系及应用
• 1.4.1 RNAi的分子机制及技术路线
• 1.4.2 RNAi技术在小麦功能基因组学研究中的应用
• 1.4.3 RNAi技术在小麦品质改良研究中的应用
• 1.4.4 RNAi在小麦研究中的不足
• 1.5 本研究的目的及意义
• 第二章 小麦体细胞杂种及双亲ω-醇溶蛋白基因的分离
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 ω-醇溶蛋白基因ORFs的克隆和测序
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 小麦体细胞杂种渐渗系Ⅱ-12及双亲中ω-醇溶蛋白基因分离和序列分析
• 2.2.2 ω-醇溶蛋白基因家族的进化分析
• 2.3 讨论
• 2.3.1 利用PCR技术扩增ω-醇溶蛋白基因
• 2.3.2 来自于小麦体细胞杂种渐渗系Ⅱ-12的ω-醇溶蛋白基因的变异分析
• 2.3.3 ω-醇溶蛋白可能的功能
• 第三章 α/β-醇溶蛋白基因RNAi载体的构建及转化小麦的研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 RNA干扰载体pTCK303-Ubi-AR12和pTCK303-Ubi-AR34的构建
• 3.1.3 植物表达载体p3301-Ubi-AR12与p3301-Ubi-AR34的构建
• 3.1.4 农杆菌介导的小麦苗端转化
• 3.1.5 转基因植株的PCR筛选
• 3.1.6 转基因小麦籽粒醇溶蛋白的A-PAGE分析
• 3.1.7 利用SDS-PAGE分析籽粒麦谷蛋白的变化
• 3.2 结果
• 3.2.1 α-醇溶蛋白基因RNA干扰片段的确定
• 3.2.2 RNA干扰载体pTCK303-Ubi-AR12和pTCK303-Ubi-AR34的构建
• 3.2.3 植物表达载体p3301-ub-AR12与p3301-ubi-AR34的构建
• 3.2.4 苗端转化法转化小麦及转基因植株的检测
• 3.2.5 转基因小麦籽粒醇溶蛋白的A-PAGE条带分析
• 3.2.6 转基因小麦籽粒谷蛋白的SDS-PAGE分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 农杆菌转化问题
• 3.3.2 影响RNAi介导的基因沉默问题
• 参考文献
• 致谢
• 硕士在读期间发表及投稿的文章
• 硕士在读期间参加的学术会议
• 硕士期间所获奖励
• 学位论文评阅及答辩情况表