绿脓杆菌蛋白酶IV的cDNA克隆及表达

论文摘要

绿脓杆菌蛋白酶Ⅳ（Ps-Ⅳ）是假单胞菌属绿脓杆菌分泌的一种胞外蛋白酶和致病因子,能特异性水解赖氨酸羧基末端所形成的肽键,而对其他肽键无水解能力,属于赖氨酸特异性蛋白水解酶。能降解许多重要的生物活性蛋白,如纤维蛋白原、纤溶酶原、补体蛋白C3、补体蛋白Clq和免疫球蛋白G等。本文主要通过将实验获得的Ps-Ⅳ成熟肽基因克隆至合适的表达载体,以获得其活性表达。首先以绿脓杆菌CMCC（B）10104菌株为考察对象,对其培养液进行赖氨酸特异性蛋白水解酶活性分析,结果表明绿脓杆菌CMCC（B）10104可能分泌蛋白酶Ⅳ。实验提取了绿脓杆菌CMCC（B）10104基因组DNA,以文献报道的其它绿脓杆菌菌株分泌的Ps-Ⅳ基因序列为基础合成引物,PCR扩增得到Ps-Ⅳ成熟肽基因,克隆至载体pGM-T中进行测序,结果表明,与其它不同来源的Ps-Ⅳ基因序列具有很高同源性。将Ps-Ⅳ克隆至载体pET-28a中,构建质粒pET-28a-Tag（his）-Ps-Ⅳ,通过质粒测序验证,证明Ps-Ⅳ基因序列无突变,插入位点正确。运用E.coli BL21对pET-28a-Tag（his）-Ps-Ⅳ进行表达,SDS-PAGE结果表明重组蛋白得到表达,但主要以包涵体形式存在。将Tag（his）-Ps-Ⅳ重新克隆至表达载体pNJUTRX中,构建质粒pNJUTRX-Tag（his）-Ps-Ⅳ,通过质粒测序验证,证明Ps-Ⅳ基因序列无突变,插入位点正确。运用E.coli BL21对pNJUTRX-Tag（his）-Ps-Ⅳ进行表达,SDS-PAGE结果表明重组蛋白得到表达,可溶性表达不低于50%。通过正交试验对表达条件进行初步考察,结果表明,加入IPTG后培养时间对可溶性重组蛋白表达量有较大影响,而IPTG终浓度和培养温度无明显影响。利用金属螯合层析、离子交换层析和凝胶过滤层析等方法,从表达系统pNJUTRX-Tag（his）-Ps-Ⅳ/E.coli BL21的表达产物中纯化得到电泳纯Ps-Ⅳ。酶活测定表明得到的Ps-Ⅳ具有赖氨酸特异性蛋白水解酶活性,1L发酵液得到Ps-Ⅳ蛋白0.12毫克,为0.25个酶活单位。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 Ps-Ⅳ成熟肽基因的获得
• 1.实验材料与仪器
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 引物
• 1.3 试剂
• 1.4 仪器
• 2.实验方法
• 2.1 绿脓杆菌培养及培养液处理
• 2.2 绿脓杆菌培养液Ps-Ⅳ酶活测定
• 2.3 琼脂糖凝胶电泳
• 2.4 绿脓杆菌基因组DNA的提取
• 2.5 Ps-Ⅳ成熟肽基因的获得
• 3.实验结果
• 3.1 绿脓杆菌培养液Ps-Ⅳ酶活测定
• 3.2 绿脓杆菌基因组DNA的提取
• 3.3 前体基因Ps-Ⅳ-1的PCR扩增
• 3.4 成熟肽基因Ps-Ⅳ的PCR扩增
• 3.5 含重组质粒细菌菌落的鉴定
• 4.小结
• 5.讨论
• 第二章 pET-28a-Tag（his）-Ps-Ⅳ的构建及表达
• 1.实验材料与仪器
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 引物
• 1.3 试剂
• 1.4 仪器
• 2.实验方法
• 2.1 重组质粒pET-28a-Tag（his）-Ps-Ⅳ的构建
• 2.2 重组质粒pET-28a-Tag（his）-Ps-Ⅳ的表达
• 3、实验结果
• 3.1 插入片段的PCR扩增
• 3.2 载体pET-28a双酶切
• 3.3 含重组质粒细菌菌落的鉴定
• 3.4 重组质粒pET-28a-Tag（his）-Ps-Ⅳ的表达
• 4.小结
• 5.讨论
• 第三章 pNJUTRX-Tag（his）-Ps-Ⅳ的构建及表达
• 1.实验材料与仪器
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 2.实验方法
• 2.1 表达载体pNJUTRX-Tag（his）-Ps-Ⅳ的构建
• 2.2 pNJUTRX-Tag（his）-Ps-Ⅳ的诱导表达
• 2.3 分离纯化
• 3.实验结果
• 3.1 表达载体pNJUTRX-Tag（his）-Ps-Ⅳ的构建
• 3.2 pNJUTRX-Tag（his）-Ps-Ⅳ的诱导表达
• 3.3 分离纯化
• 4.小结
• 5.讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢