HGT-5A免疫药理学及其抗实验性类风湿关节炎作用研究

论文摘要

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种慢性炎症性系统性自身免疫性疾病,以关节滑膜炎及对称性、破坏性的关节病变为主要特征。目前类风湿关节炎的病因及发病机制仍不完全清楚,可能与自身反应性T淋巴细胞异常活化、Th1/Th2平衡紊乱、致炎性细胞因子TNF-、IL-1?、IL-17等异常增多等因素有关。治疗类风湿关节炎的药物主要分为非甾体抗炎药（nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs）、改善病情抗风湿药（disease-modifying anti-rheumaticdrugs,DMARDs）、糖皮质激素。上述药虽具有较好的疗效,但由于不良反应较多或者较重,患者中断治疗的比率较高。因此,开发疗效确切且毒副作用小的抗风湿药刻不容缓。黑骨藤为萝摩科（Asclepiasaceae）杠柳属（Periploca Linn.）植物,主产于西南地区的贵州等地,是苗族常用民间抗风湿草药。该药味苦、辛,性凉,小毒,具有祛风除湿、活血通络、消痹止痛的功效,在民间广泛应用于治疗风湿关节痛,跌打损伤,月经不调等。本课题组通过活性追踪的方法对黑骨藤全株进行化学分离和提取,筛选出水溶性较好、活性较高、毒副作用较小的多糖部位HGT-5A。对HGT-5A进一步分离提取,得到中性糖部位HP1及其多糖组分HP1-1,HP1-3,HP1-4,以及酸性糖部位HP2及其多糖组分HP2-2,HP2-3,HP2-4,其中HP1-1,HP1-3,HP1-4,HP2-2,HP2-3,HP2-4均为分子量均一多糖。本研究拟在前期研究的基础上,首先在细胞水平对HGT-5A及其多糖组分的免疫活性进行评价,进而在整体动物水平利用多种免疫功能紊乱模型对HGT-5A的免疫药理作用进行较为系统的研究,最后,观察HGT-5A对类风湿关节炎动物模型的治疗作用,旨在为开发抗类风湿关节炎新药提供实验依据。一、HGT-5A及其多糖组分体外免疫活性评价分别采用小鼠淋巴细胞增殖反应实验和噻唑蓝（MTT）实验对HGT-5A的免疫活性及淋巴细胞活性进行初步评价。结果表明,HGT-5A体外应用可不同程度的促进脾细胞自发增殖反应,明显抑制刀豆蛋白（Concanavalin A,Con A）和anti-CD3抗体诱导的小鼠T淋巴细胞增殖反应,对LPS诱导的B淋巴细胞增殖反应及脾细胞培养上清中IgG的分泌水平均无明显影响,提示HGT-5A对T细胞增殖具有抑制作用,对B细胞增殖无明显影响。HGT-5A体外应用对脾细胞活性无明显影响,提示其对T细胞增殖反应的抑制作用不是由直接细胞毒作用引起的。脾细胞自发增殖模拟了体内的免疫反应过程,由抗原递呈细胞提呈抗原,引起T细胞活化。HGT-5A对脾细胞的自发增殖有促进作用可能是作用于其中的某一环节。而Con A作为有丝分裂原主要是通过与T细胞表面TCR和CD2结合继而导致T细胞非特异性活化,HGT-5A对这一过程表现出抑制作用。LPS可与B细胞表面TLR4（Toll like receptor 4）结合,多克隆活化B细胞,HGT-5A对这一过程无明显影响。随后观察不同浓度HGT-5A多糖组分HP1、HP2及其进一步分离的组分HP1-11-4、HP2-22-4对小鼠脾细胞增殖反应的影响。结果表明,均一多糖HP1-1,HP1-3,HP1-4,HP2-2,HP2-3,HP2-4亦可抑制T细胞增殖,是HGT-5A抑制细胞免疫反应的物质基础之一。以上结果亦提示,HGT-5A多糖成分可能是黑骨藤发挥抗炎和免疫作用的活性成分之一。二、HGT-5A体内应用对小鼠免疫功能的影响体外实验表明HGT-5A对T细胞增殖有抑制作用,且无明显的直接细胞毒作用,接下来我们采用三种不同免疫功能紊乱模型即:DTH模型、OVA致敏模型及胶原致敏模型来观察HGT-5A体内应用对免疫功能的影响。迟发型超敏反应（delayed hypersensitivity response,DTH）是主要由T细胞活化介导的细胞免疫应答。在本实验中我们选择临床上常用的激素抗炎药醋酸泼尼松和中药雷公藤多甙作为阳性对照药物,实验结果显示泼尼松（15 mg/kg）、雷公藤多甙（30 mg/kg）均能明显抑制模型小鼠的耳肿胀。HGT-5A 50和100 mg/kg灌胃给药可明显减轻DTH模型小鼠耳肿胀,抑制DTH反应,表明HGT-5A对T细胞介导的细胞免疫应答具有明显的抑制作用。采用脾细胞增殖反应观察HGT-5A对ConA诱导的DTH模型小鼠脾细胞增殖功能的影响,结果显示HGT-5A各剂量组均可不同程度的抑制Con A诱导的T细胞增殖。采用流式细胞术检测脾细胞中细胞亚群的比例,结果显示HGT-5A具有上调CD3+、CD4+、CD8+细胞比例,下调模型小鼠升高的CD4+/CD8+比值的作用。上述结果表明,HGT-5A对DTH模型小鼠T细胞亚群紊乱有明显改善作用。已知Th0细胞根据分泌细胞因子的不同可分为Th1、Th2细胞亚群,二者之间相互影响相互制约,它们之间的失衡与多种自身免疫性疾病密切相关。卵清蛋白（ovalbumin,OVA）致敏模型是Th2免疫应答占优势的Th1/Th2平衡紊乱疾病模型。采用该模型主要观察HGT-5A体内应用对特异性致敏原介导的Th1/Th2平衡的影响。Th0细胞因子可介导Ig的类别转换,如Th1细胞因子IL-4可介导IgM向IgG2a的类别转换,Th2细胞因子如IFN-γ主要介导IgM向IgG1的类别转换。检测血清中IgG1和IgG2a水平可以间接反映Th1/Th2细胞因子分泌状况。本研究结果显示,OVA致敏小鼠血清OVA特异性总IgG、IgG1在致敏后1周明显升高,表明Th2免疫应答占优势;血清OVA特异性IgG2a水平在致敏后2周也明显升高,表明Th1/Th2平衡向Th1方向稍有恢复,但仍表现为Th2优势。HGT-5A给药4周对特异性抗体IgG1、IgG2a的分泌有明显抑制作用,提示HGT-5A抑制Th细胞因子分泌,可能对特异性致敏原介导的Th1/Th2分化平衡有一定的调节作用。文献报道,该模型小鼠CD4+细胞比例明显下调,CD8+细胞比例明显上调,而CD8+细胞中主要是效应性T细胞,其能促进IL-5释放,进一步加重免疫反应。流式细胞术检测脾细胞中细胞亚群的比例,结果显示,HGT-5A 100 mg/kg灌胃给药可上调CD4+细胞比例,下调CD8+细胞比例,调节CD4+/CD8+比值,提示HGT-5A体内应用可降低效应性T细胞数量,调节T细胞亚群平衡。Ⅱ型胶原（Collagen II,CII）是由细胞免疫、体液免疫及大量致炎性细胞因子等多种因素参与的免疫损伤模型。Th1免疫应答占优势的Th1/Th2失衡,TNF-?、IL-1?、?L???等致炎细胞因子分泌增加以及Ⅱ型胶原抗体的产生是Ⅱ型胶原致敏模型发病的主要环节。本研究结果表明,HGT-5A 100、250 mg/kg灌胃给药4周可明显升高血清中IgG1抗体水平、明显降低IFN-γ和IL-4含量及IFN-γ/IL-4比值,使模型小鼠机体免疫状态向Th2方向恢复,提示HGT-5A具有调节Th1/Th2平衡的作用。研究还发现,胶原致敏小鼠炎性细胞因子IL-1?和TNF-、?L???分泌增加,HGT-5A能明显降低上述细胞因子分泌,提示HGT-5A具有抑制炎症反应的作用。特异性Ⅱ型胶原抗体水平升高是Ⅱ型胶原致敏小鼠的特征性变化之一。研究结果表明,模型小鼠血清中有高滴度的CⅡ特异性IgG,但HGT-5A对其分泌无明显影响,对B细胞增殖也无明显影响,提示HGT-5A体内应用可能对B细胞介导的体液免疫应答无明显影响。综合上述研究结果,我们认为,HGT-5A体内、外应用对T细胞介导的细胞免疫反应有明显抑制作用,对特异性抗原介导的Th1/Th2平衡具有调节作用,且对TNF-?、IL-1?、IL-17等炎性细胞因子的分泌具有明显抑制作用。而T淋巴细胞异常活化增殖、Th1/Th2平衡紊乱、致炎性细胞因子分泌是类风湿关节炎发病的主要机制。因此,我们推测HGT-5A可能有抗类风湿关节炎作用。三、HGT-5A对胶原诱导性关节炎的治疗作用胶原诱导性关节炎（Collagen induced arthritis,CIA）模型由Trentham等于1977首次建立,该模型发病机制及临床特征与RA最为相似,模型也较为稳定,是研究RA发病机制和筛选治疗RA药物的理想模型,也是目前国际上公认的关节炎模型。本研究采用CIA小鼠模型评价了HGT-5A的抗类风湿作用,结果显示,模型小鼠在初次免疫第27天后双侧后肢足爪厚度逐渐增加,关节炎评分亦随着时间呈进行性升高,与文献报道一致,说明造模成功;HGT-5A 250 mg/kg灌胃给药早期能一定程度降低CIA小鼠足爪厚度,降低关节炎评分,减轻关节炎发病程度,提示HGT-5A可能具有延缓CIA模型小鼠发病的作用。进一步研究发现,HGT-5A 50和250 mg/kg灌胃给药能明显抑制CⅡ特异性T细胞增殖。通过以上研究,本论文主要得到以下结论:1、HGT-5A能够抑制有丝分裂原诱导的T细胞增殖。中性糖部位HP1及其多糖成分HP1-1,HP1-3,HP1-4,以及酸性糖部位HP2及其多糖成分HP2-2,HP2-3,HP2-4是HGT-5A发挥免疫活性的物质基础之一。2、HGT-5A体内、外应用对T细胞介导的细胞免疫反应有明显抑制作用,可能对B细胞介导的体液免疫反应无明显影响,但对特异性抗原介导的Th1/Th2平衡具有调节作用,且对TNF-?、IL-1?、IL-17等炎性细胞因子的分泌具有明显抑制作用。3、HGT-5A一定程度的改善关节炎症状,延缓CIA模型小鼠的发病,可作为抗类风湿关节炎的候选药物进行进一步研究。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料与方法
• 一、实验材料
• 二、实验方法
• 三、统计学处理
• 实验结果
• 一、HGT-5A 及其各多糖组分体外免疫活性评价
• 1.H GT-5A 及其各多糖组分体外应用对小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响
• 2.H GT-5A 体外应用对T 细胞增殖功能的影响
• 3.H GT-5A 体外应用对脾细胞培养上清IgG 含量的影响
• 4.H GT-5A 体外应用对小鼠脾淋巴细胞活性的影响
• 二、HGT-5A 体内应用对免疫功能的影响
• 1.H GT-5A 体内应用对DTH 模型的影响
• 1.1 HGT-5A 对小鼠体重的影响
• 1.2 HGT-5A 对小鼠耳肿胀的影响
• 1.3 HGT-5A 对小鼠脾细胞增殖反应的影响
• 1.4 HGT-5A 对小鼠淋巴细胞亚群的影响
• 2.H GT-5A 体内应用对OVA 致敏模型免疫功能的影响
• 2.1 HGT-5A 对血清OVA 特异性抗体水平的影响
• 2.2 HGT-5A 对OVA 模型小鼠脏器指数的影响
• 2.3 HGT-5A 对小鼠淋巴细胞亚群的影响
• 3.H GT-5A 对CⅡ致敏模型免疫功能的影响
• 3.1 HGT-5A 对小鼠Th1/Th2 细胞因子的影响
• 3.2 HGT-5A 对小鼠培养上清中TNF- 的影响
• 3.3 HGT-5A 对小鼠培养上清中IL-1β的影响
• 3.4 HGT-5A 对小鼠培养上清中IL-17 的影响
• 3.5 HGT-5A 对血清抗体含量和B 细胞增殖功能的影响
• 三、HGT-5A 对胶原诱导性关节炎小鼠的治疗作用
• 1.C IA 小鼠关节炎症状
• 2.H GT-5A 对CIA 模型小鼠双侧后肢足爪厚度的影响
• 3.H GT-5A 对CIA 模型小鼠关节炎评分的影响
• 4.H GT-5A 对CIA 模型小鼠发病率及严重程度的影响
• 5.H GT-5A 对CIA 模型小鼠脏器指数的影响
• 6.H GT-5A 对CIA 小鼠T 细胞增殖功能的影响
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 个人简历
• 致谢