论文题目: 家蚕生物反应器表达人乳铁蛋白及其功能研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化学与分子生物学
作者: 刘涛
导师: 张耀洲
关键词: 人乳铁蛋白,家蚕幼虫,重组杆状病毒,抑菌作用,结肠炎
文献来源: 浙江大学
发表年度: 2005
论文摘要: 人乳铁蛋白是一种多功能的铁结合糖蛋白。本研究利用家蚕核型多角体杆状病毒表达系统成功表达了重组人乳铁蛋白。本实验运用RT-PCR技术从人的乳腺组织中克隆了人乳铁蛋白（hLF）cDNA。BLAST分析测序结果表明重组人乳铁蛋白其DNA序列与GenBank中另外4个hLF cDNA序列具有高度的同源性（同源性达到99％）。序列之间的差异可能是由hLF mRNA本身的多态性造成，也可能是由于中国人hLF的特殊性引起。这些差异引起的氨基酸变化对人乳铁蛋白生物活性的影响还有待于进一步研究。 将人乳铁蛋白cDNA克隆在质粒pBacPAK8的Bam HⅠ位点和Xho Ⅰ位点，构建成重组转移质粒pBacPAK-hLF。该质粒DNA与已线性化BacPAK6 DNA共转染家蚕细胞BmN，在培养的贴壁细胞中挑出空斑，经过3轮纯化，获得重组病毒vBm-hLF。 本研究利用重组病毒感染家蚕细胞和家蚕幼虫作为宿主表达重组人乳铁蛋白。经12％SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明在重组病毒感染的家蚕细胞和家蚕幼虫中存在人乳铁蛋白基因的表达产物。表达产物分子量约为78kDa，略低于天然乳铁蛋白分子量，估计可能为不完全糖基化或者蛋白降解造成。 在感染了重组病毒的家蚕细胞中，大约105家蚕细胞可以获得13.5μg rhLF。体外生物活性研究表明重组人乳铁蛋白和天然乳铁蛋白具有类似的抑菌活性，能够抑制大肠杆菌的生长，而且重组人乳铁蛋白的抑茵活性还稍强些。这可能与蛋白的糖基化程度和结合铁的饱和度不同有关。此研究为重组人乳铁蛋白作为一种食品，医药，化妆品中的天然有效的抗菌剂提供了理论基础。 在感染了重组病毒的家蚕幼虫中，大约每升家蚕血淋巴中可以获得192毫克重组人乳铁蛋白。重组人乳铁蛋白表达量在感染重组病毒120小时后达到最大，随后迅速降低。体内生物活性研究了重组人乳铁蛋白对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠急性结肠炎的预防作用。研究结果表明重组人乳铁蛋白可以显著的抑制DSS诱导的结肠炎症状，这为重组人乳铁蛋白作为急性肠道疾病的治疗剂或者辅助治疗剂提供了理论依据。
论文目录:
中文摘要
英文摘要
第一部分 文献综述
第一章 人乳铁蛋白的研究进展
1 分布和含量
2 乳铁蛋白的分离及含量测定
2.1 乳铁蛋白的分离
2.2 乳铁蛋白的含量测定
3 乳铁蛋白的分子结构
4 乳铁蛋白的糖基化反应
5 乳铁蛋白的配基作用
6 乳铁蛋白受体
7 乳铁蛋白与转铁蛋白
8 生物学功能
8.1 参与铁代谢
8.2 广谱抗菌活性
8.3 抗病毒活性
8.4 抗炎和免疫调节作用
8.5 细胞繁殖中的作用
8.6 对基因表达的调控
8.7 抗肿瘤作用
8.8 抗氧化活性
9 乳铁蛋白基因
10 重组人乳铁蛋白
11 人乳铁蛋白转基因研究
12 对重组人乳铁蛋白主要理化性质和生物活性的分析
13 人乳铁蛋白转基因研究的展望
14 乳铁蛋白的开发和应用前景
第二章 家蚕/BmNPV表达系统研究进展
1 杆状病毒的生活循环
2 杆状病毒的基因及其功能
2.1 编码多角体有关的蛋白质的基因
2.2 编码病毒体结构蛋白基因
3 杆状病毒表达系统的建立及其原理
4 杆状病毒载体表达系统的改进
4.1 重组病毒筛选方法的改进
4.2 提高病毒重组效率方面的改进
4.3 杆状病毒转移载体的改进
5 杆状病毒载体表达系统的特点
5.1 杆状病毒表达系统的优点
5.2 家蚕/ Bm NPV系统相对于 Sf细胞/AcNPV系统的优势
5.3 杆状病毒表达系统存在的缺陷
6 BESV的表达水平及其影响因素
第二部分 研究报告
第一章 实验设计方案
1 本研究的目的和意义
2 本研究的主要内容
3 实验流程图
第二章 人乳铁蛋白基因cDNA的克隆
1 材料和方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 RNA浓度测定
2.2 hLf cDNA克隆
3 讨论
3.1 RNA提取
3.2 cDNA合成与克隆
第三章 家蚕杆状病毒重组转移载体的构建
1 材料和方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 重组转移载体pBacPAK-hLf的构建
2.2 重组转移载体pBacPAK-hLf的鉴定
2.3 hLf cDNA的DNA序列分析
3 讨论
第四章 重组家蚕杆状病毒的筛选和鉴定
1 材料和方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 病毒 Bm-BacPAK_6 DNA的线性化
2.2 共转染及重组病毒的筛选
2.3 重组病毒的鉴定
2.4 重组病毒的滴度测定
3 讨论
第五章 rhLf在家蚕细胞、幼虫中的表达及纯化
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 hLf标准曲线绘制
2.2 rhLf在家蚕细胞中的表达
2.3 rhLf在家蚕幼虫中的表达
2.4 质谱鉴定分析
3 讨论
第六章 家蚕杆状病毒表达系统表达的rhLf的生物活性研究
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 rhLf的体外抑菌作用
2.2 rjLf对 DSS诱导的结肠炎的预防作用
3 结论
致谢
攻读博士学位期间的研究成果及发表的学术论文
发布时间: 2006-09-06
参考文献
- [1].人乳铁蛋白基因克隆、表达及转基因动物制备[D]. 曹阳.大连理工大学2003
- [2].腺病毒介导的人乳铁蛋白基因在兔和羊乳腺中高效表达的研究[D]. 韩增胜.西北农林科技大学2006
- [3].人溶菌酶/乳铁蛋白双基因表达载体的构建与转基因牛克隆胚的体外发育[D]. 曹俊伟.西北农林科技大学2012
相关论文
- [1].家蚕丝腺生物反应器表达hGM-CSF转基因载体的构建及应用研究[D]. 周文林.苏州大学2007
- [2].家蚕生物反应器表达hIL-28A及其抗肿瘤能力评价[D]. 陆叶.苏州大学2010
- [3].家蚕生物反应器生产的BmrhGM-CSF胶囊Ⅰ期临床试验及口服吸收机制的研究[D]. 张文平.浙江大学2010
- [4].家蚕蛹表达人生长激素蛋白及其生物活性的研究[D]. 蓝航莲.浙江大学2009
- [5].家蚕/BmNPV表达载体系统高效表达人乙肝表面抗原（PreS2+S）及表达产物免疫原性的研究[D]. 杨瑞丽.浙江大学2002
- [6].人乳铁蛋白基因克隆、表达及转基因动物制备[D]. 曹阳.大连理工大学2003
- [7].家蚕生物反应器高效表达人干扰素α—胸腺肽α1融合基因、干扰素β与干扰素β突变体基因及其产物生物活性的初步研究[D]. 郭冬生.浙江大学2004
- [8].家蚕表达霍乱毒素B亚基与人胰岛素或胰岛素B链融合蛋白及其抗自身免疫性糖尿病的研究[D]. 龚朝辉.浙江大学2006
- [9].纳豆激酶和hGM-CSF在家蚕杆状病毒表达系统中表达纯化及活性研究[D]. 朱立成.浙江大学2005
- [10].家蚕生物反应器表达人GM-CSF的研究[D]. 陈健.浙江大学2005