人骨形态发生蛋白-7成熟肽的表达及其生物学活性的初步研究

论文摘要

骨形态发生蛋白（Bone morphogenetic proteins，BMPs）是一种多功能蛋白，是转化生长因子（transforming growth factor-beta，TGF-β）超家族成员之一，为目前发现的一类具有异位成骨能力的细胞因子，它能刺激间充质细胞向成骨细胞分化。人骨形态发生蛋白-7（hBMP-7）又称为成骨蛋白-1（Osteogenic Protein-1，OP-1），由于其具有较强的骨诱导能力而受到人们广泛关注。它与Ⅰ型胶原蛋白的缓释体移入骨干缺损部位，会导致有功能的新骨形成，显示出应用于骨与关节及软骨缺损修复的前景。而且同时对神经系统、造血系统的分化发育也有调控作用。hBMP-7基因编码431个氨基酸，由N端的信号肽、中间区域的前肽和C端的成熟肽三部分组成，翻译后的前体需要进一步的加工修饰，包括切掉信号肽和前肽，其成骨活性主要表现在C端的成熟肽区。hBMP-7成熟肽含有139个氨基酸，单体分子量约15.7kD，带有3个糖基化位点及7个半胱氨酸残基。天然hBMP-7存在同源或异源二聚体形式，二聚体的hBMP-7是其生物学活性的主要形式。制备hBMP-7成熟肽主要的研究工作包括以下三个方面：1．采用pMAL-p2x表达载体，在原核系统中获得了hBMP7-MBP融合蛋白的可溶性高效表达，并通过亲和纯化得到纯度约为80％的融合蛋白，利用Factor Xa蛋白酶对融合蛋白酶切后，得到目的蛋白hBMP-7成熟肽，以单体形式存在。2．鉴于毕氏酵母（Pichia pastoris）表达系统能对重组蛋白进行翻译后必要的剪接、正确的折叠和修饰，糖基化形式更接近于高等真核生物，因此选用此表达系统，将hBMP-7成熟肽基因克隆入表达载体pPIC9K，用SalⅠ酶将重组质粒线性化，电转化入Pichia pastoris SMD1168细胞，G418抗性筛选出阳性整合子，确定Mut+表型进行甲醇快速诱导，并对其培养和诱导条件进行一定的探索和优化。经过整合子的筛选和表达条件的优化，最终筛选到目的蛋白表达量占上清蛋白8％的分泌表达株，表达量为0.6mg／L，酶联免疫检测及蛋白印迹结果表明，表达的重组蛋白与抗hBMP-7抗体具有特异结合活性，提示重组表达蛋白具有天然蛋白的分子构象。3．为了提高目的蛋白的表达量，依据毕氏酵母的密码子偏好性，对hBMP-7成熟肽基因进行基因修饰，最终确定以含三个精氨酸突变位点的酵母菌作为表达株进行扩大培养，经Ni-NTA柱纯化得到纯度为80％的蛋白样品，基因修饰后的hBMP-7成熟肽在毕氏酵母中的表达水平提高了约4倍，产量为2.5mg／L。所得hBMP-7成熟肽在还原状态下以分子量约18kD的单体形式存在，在非还原状态下以二聚体形式存在，分子量约为36kD左右，重组蛋白经PNGase F糖苷酶酶切分析证明其在毕氏酵母中发生了N糖基化。细胞学实验证实制备的hBMP-7成熟肽具有一定的生物学活性，能够促进成纤维细胞向成骨细胞转化。综上所述，本研究利用毕氏酵母系统成功分泌表达了hBMP-7成熟肽，并能形成有生物学活性的二聚体形式，为今后hBMP-7的功能研究奠定了基础。

论文目录

• 中英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 hBMP-7成熟肽基因在原核系统中的分泌融合表达
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 hBMP-7成熟肽基因在毕氏酵母中的分泌表达
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 hBMP-7成熟肽基因修饰与分泌表达及其生物学活性初步研究
• 1 hBMP-7成熟肽基因修饰
• 材料与方法
• 结果
• 2 突变基因和人工合成基因在毕氏酵母中的分泌性表达
• 材料和方法
• 结果
• 3 hBMP-7重组蛋白的细胞学活性初步研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 攻读学位期间发表论文
• 致谢